关于筛选曲霉种间产淀粉酶条件的改进

　　淀粉酶作用于淀粉生成葡萄糖。淀粉是生物尤其是人类营养所利用的最大量碳源， 而葡萄糖则是生物碳素营养与代谢的中心枢纽， 因此奠定了淀粉酶的重要作用。啤酒酿造、黄酒酿造、蒸馏酒生产无一不是利用了淀粉酶的重要性质与功能。

　　淀粉酶还可用于酶法生产葡萄糖、麦芽糖、糊精、助消化药剂和发酵食品。它还是一些食品和饲料添加剂的主要成分。此外淀粉酶可直接用于丝、棉纺织工业中的脱浆处理。事实上，淀粉酶是最早实现了工业生产， 目前应用最广、产量最大的一个酶制剂品种， 其产量占整个酶制剂行业总产量的50%以上， 其中又以曲霉淀粉酶所占份额最大。

　　据统计， 现代酶制剂工业产品约有三分之二来自曲霉。关于酿造微生物的育种研究大多是将两种或更多优良工业性状综合到一个菌株中去。上世纪八九十年代 日本学者运用种间和属间原生质体融合技术在曲霉蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶分泌能力的遗传改良方面作过一些探索。本研究旨在优化已筛选的曲霉种间产淀粉酶的条件。

　　1 材料与方法

　　1.1 供试亲株

　　试验用 2 个曲霉出发菌株，一个是黑曲霉M70 （Aspergillus niger V. Tiegh M70）， 下文简写为 M70, 为酸性蛋白酶（PEP） 高产菌株； 另一个是米曲霉 M4 （Aspergillus oryzaeAhlb. M4）， 下文简写为 M4, 为中性蛋白酶（NP）、碱性蛋白酶（ALP） 和淀粉酶（AMY） 高产菌株。两亲株均为华中农业大学食品微生物学研究室保藏菌种。若干融合子来自前期工作。

　　1.2 主要培养基察氏培养基（MM）， 即基本培养基， 用于菌种鉴定与形态观察。

　　淀粉- 麸皮- 硫铵培养基： 麸皮 8 g, 淀粉 2 g,2%硫酸铵溶液 10 mL.淀粉- 麸皮- 豆粕培养基： 麸皮 4 g, 淀粉 2 g,豆粕 4 g, 自来水 10 mL.马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）， 用于菌种保存、活化、继代。

　　需要说明的是： ①所有上述合成培养基当需要采用固体或液体培养时， 只需加入或不加入 20g/L 琼脂。②所有合成培养基灭菌条件是 115 ℃、20min;所有天然、半天然培养基灭菌条件是 121℃、

　　1.3 主要测试指标及方法

　　1.3.1 生物量测定 采用 Nohmi 培养基测定融合子液培生物量， 重复 3 次以上。

　　1.3.2 淀粉酶活性测定 依 DNS 法测定。定义 1 h 生成 1 mg 葡萄糖当量产物所需酶量为 1 个酶活单位。固体曲浸酶条件同蛋白酶浸提方法。重复测定 3 次以上。

　　1.3.3 蛋白质含量测定 按 Bradford 法用凯氏定氮仪测定，重复 3 次以上。

　　2 结果与讨论

　　2.1 氮源对融合子生物量的影响

　　不同菌株对同一氮源， 和同一菌株对不同氮源及不同含氮量的利用能力均不一样， 甚至同一菌株对同一氮源的利用情形还因菌龄不同而各异（见表 1）。氮源因子对营养生长的效应： 豆粕>鱼粉>蛋白胨， 所得平均生物量分别为 4.47、4.44 和1.86 g.无机氮源明显差多了， 硝酸钠略强于硫酸铵，只有 F05 能利用少量硫酸铵， 其余均不能利用。这说明双亲及 F69 均无利用 NH4+- N 的生化能力， 而 F05 有此能力。

　　因此 M70、M04 及 2 株融合子利用有机氮能力远远大于无机氮。各菌株利用氮源的能力差异顺序： F05>M4>M70>F69, M70 与F69 生物量相近， M4 与 F05 的相近； M4 和 F05利用蛋白胨的能力相近， 比 M70 和 F69 高近40%.F69 利用鱼粉能力优于 M70, M70 利用豆粕能力高于 F69, 还有 M4 和 F05 利用 NO3- N 能力优于 M70 和 F69.在氮源比较单一和贫乏时， M4和 F05 适应能力明显比 M70 和 F69 强， 但 5 d 与3 d 观测结果不尽相同： ①氮源效应从大到小依次为 NaNO3>NH4NO3>（NH4）2SO4）≥脲； ②各菌株生物量大小顺序为 F05>M4>F50>M70>F69, F05超出高亲， F69 则低于低亲， F50 居于双亲之间；③当 （NH4）2SO4仍为 2%时， 如 3d 时一样， M70F69、F50 仍表现出 NH4+阻遏效应， 不同的是 M4表现部分解铵阻遏效应， 生物量为 1.098g（FW）。

　　可见随着培养时间的延长， 铵对 M4 的阻遏可以被部分解除； ④将硫酸铵培养基中氮源含率由 2%降至 0.2%时， 所有 NH4+阻遏效应均被部分或全部解除。可见 NH4+阻遏效应的表现是以较高 NH4+浓度为前提的； ⑤在淀粉培养基与 4 种氮源配合中，脲效应与（NH4）2SO4几乎完全相同， 即 M70、F69、F50 均表现明显脲阻遏效应， 唯独 F05 和 M4 能利用脲生长， 表现出解脲阻遏性状。⑥所有菌株都能利用 2%NaNO3, 与 3 d 时的结果相同。

　　2.2 氮源对亲株及融合子淀粉酶分泌量的影响

　　分析表可得出如下结论：

　　①有机氮源更有利于产淀粉酶。在 3 d 时， 产淀粉酶的氮源顺序为豆粕>鱼粉>蛋白胨； 5 d 时变化为豆粕>蛋白胨>鱼粉。②产淀粉酶菌株差异表现稳定， 不因菌龄和氮源不同而变化， 其顺序均为 M70>M4>F05>F69, 极差达 4.87 倍（5 d） 至 7.37 倍（3 d）。

　　具体分析发现（ 以 5d 为依据）： ①以蛋白胨作为氮源时， 只有M70 和 F05 有酶活， 分别为 525 U/mL 和 98 U/mL, 前者比后者高 4.4 倍； ②当氮源是豆粕时，M70 和 F69 酶活分别为 1 329 U/mL 和 325 U/mL,悬殊 3.1 倍， 而 M4 和 F05 酶活分别为 251 U/mL和 160 U/mL, 悬殊达 56%; ③当以鱼粉为氮源时，M70 和 F69 均比豆粕作氮源时低一些， 分别为921 U/mL 和 148 U/mL.而 M4 和 F05 酶活明显比豆粕作氮源时高， 分别达 379 U/mL 和 266 U/mL.可见豆粕宜于 M70 和 F69, 鱼粉宜于 M4 和 F05产淀粉酶。