中美科学家解密男性输出小管转运精子的功能

　　一个健康男性的双侧睾丸大约每天要产生上亿的精子，而这些精子在睾丸曲细精管中生成之后是不具备运动能力的，它们需要转运到附睾中继续成熟发育，直到最后形成具备运动能力和受精功能的成熟精子。而连接睾丸和附睾之间的唯一桥梁是几根输出小管，输出小管非常纤细，直径大约只有60-110微米，比精子的长度还要小（小鼠精子长度约125微米）【1】。

　　小鼠的输出小管从睾丸网分出后形成4-5根这样的小管，然后又汇聚一起连接到附睾头部（图1）；在高等动物的输出小管分支稍多一点，人约有10-15根这样的小管，最终融合进入附睾管，并且这部分输出小管占据约1/3的附睾头。输出小管在结构上可以理解为是连接睾丸和附睾的天然 “独木桥”，每天有来自睾丸的成千上万的精子大军涌向这样狭窄的管腔（注意：输出小管管腔直径要小于精子长度），千军万马的精子若想顺利抵达附睾，则必须要顺利通过这座“独木桥”，否则只能滞留在睾丸曲细精管中造成精子发生障碍，因此如何保障输出小管的通畅性就显得尤为重要了。

图1：雄性生殖系统手绘图显示输出小管是连接睾丸和附睾的唯一桥梁。

　　输出小管上皮中主要含有两种细胞，一种是具有运动纤毛的纤毛细胞(Ciliated cell)，一种是非纤毛细胞(Non -ciliated cell)（图2）。

图2：小鼠输出小管上皮中细胞染色图。Ci 是运动纤毛，Mv为非纤毛细胞上的微绒毛，又叫 microvilli

　　早期研究认为输出小管中纤毛细胞的运动纤毛在精子的转运过程中发挥了重要作用，而非纤毛细胞则主要发挥对睾丸液重吸收的功能【2，3】。 事实上， 运动纤毛仅分布于四个器官，分别是存在于大脑的脑室、气管、雌性输卵管以及雄性输出小管【4，5】。长期以来，人们一直认为输出小管的运动纤毛跟大脑、气管和输卵管中的运动纤毛的功能及摆动模式是相似的，均是呈现“节律波式”的摆动以促进精子在输出小管中的转运（图3），其功能类似于大脑中脑脊液、呼吸道中黏液以及输卵管中卵子的转运。这种对输出小管功能的描述已经写进了目前的教科书，被人们所熟知。然而，这一教科书式的认知，被由来自中美的生殖生物学家们彻底打破 。

图3：小鼠大脑脑室中的运动纤毛摆动录像【6】

　　近日，由美国内华达大学医学院闫威教授实验室、上海交通大学医学院徐晨/伍静文团队、美国伊利诺伊大学 Rex. A Hess 教授以及华中科技大学同济医学院的袁水桥博士合作共同在PNAS 上发表了一篇题为Motile cilia of the male reproductive system require miR-34/miR-449 for development and function to generate luminal turbulence的研究论文。

　　该论文首次观察到小鼠输出小管中的运动纤毛呈现“涡轮搅动”式的杂乱无章的摆动模式（图4），这完全刷新了以前人们对纤毛摆动的认识，这种独特的纤毛摆动模式跟其它器官（大脑、呼吸道和输卵管）中纤毛摆动模式完全不同。

图4. 输出小管中纤毛摆动录像。

　　利用高分辨率显微成像系统，该研究首次观察到了单个的输出小管纤毛细胞运动模式（图5），并通过活体成像分析技术对纤毛摆动方式作了时空分析，发现单个纤毛细胞呈现高度一致协调的“挥鞭样”运动模式，摆动幅度和力度非常大。

图5. 输出小管中单个运动纤毛细胞摆动录像。

　　从力学角度来看，这种非节律波的“涡旋”式的纤毛摆动，并不能产生前向运动的力，也就不会促进精子在输出小管中的转运；随后，该论文还观察到了， 精子在输出小管中的转运的确不依赖于运动纤毛的摆动，而是由输出小管的肌肉收缩造成的（图6）。

图6：输出小管精子运输过程中，肌肉收缩是主要动力。

　　基于这些基础的形态学观察，作者在论文中提出了一个全新的关于输出小管中精子转运的新观点，即输出小管中运动纤毛呈现的那种“挥鞭式”杂乱无章的摆动，能够使大量的从睾丸方向来源的没有活动力的精子大军处于一个悬浮状态，而不至于沉淀阻塞纤细的输出小管管腔，同时这种独特的摆动模式也可以增加睾丸来的液体与非纤毛细胞的接触时间，从而加速睾丸液的重吸收而浓缩精子，后在输出小管平滑肌收缩力的协同作用下顺利将浓缩而均匀悬浮的精子大军转运至附睾头部。

　　功能方面，研究人员还通过基因敲除技术在纤毛中特异性敲除了两个 miRNA 家族（miR-34/449），以进一步研究了输出小管中的运动纤毛的发生及机制。论文研究显示，无论 miR-34/449全身性双敲除小鼠（dKO），还是纤毛细胞条件性双敲除小鼠（ Foxj1-Cre； dKO）均表现为雄性不育，进一步表型分析发现，不育表型并不是由精子发生障碍引起的，而是由于敲除小鼠的输出小管中运动纤毛发生缺陷导致的。

　　研究发现，敲除小鼠输出小管中的运动纤毛大量缺失，成年敲除小鼠输出小管被大量精子阻塞（图7）。敲除小鼠睾丸由于精子不能正常转运至附睾而出现肿胀，大量的积液压迫曲细精管生精上皮造成生精细胞凋亡而影响到精子的生成，而且这种破坏程度随着年龄的增长而加重（图7）。非常有趣的是，研究人员通过显微手术的方式在睾丸网的位置打孔解除睾丸液所致的睾丸内高压力后，萎缩的生精上皮得到恢复，敲除小鼠睾丸内能够见到正常精子发生过程。这一研究结果提示，临床上某些少、弱精子症甚至无精子患者，其可能的首发病因 。或许不是睾丸生精障碍，而是输出小管阻塞所致；因而通过显微手术解除输出小管阻塞也许可为治疗这类疾病的提供新的思路 。

图7: miR-34/449家族敲除后导致输出小管阻塞以及运动纤毛发生缺陷。

　　机制方面，研究人员通过高通量测序技术（RNA-seq） 发现miR-34/449通过对一些控制纤毛发生的靶基因进行转录后调控来调控输出小管中的运动纤毛的生成（图8），从而首次在动物水平证实了非编码小 RNA 可以参与调控输出小管中运动纤毛发生，为非编码小 RNA调控运动纤毛发生开拓了新方向。

图8：miR-34/449家族调控输出小管中纤毛发生的机制示意图。

　　编者续：

　　非常值得一提的是，此研究论文所运用的技术手段非常基础，仅仅利用基因敲除动物模型、最基本的形态学观察及巧妙的动物手术设计，就获得了新发现，“勘误”了长期以来人们默认的“事实”。另外，据悉这篇 PNAS 文章是闫威教授实验室2014年发表的一篇 PNAS 文章的延伸【7】。2014年，闫威教授实验室在 PNAS、加州大学伯克利分校的Lin He 实验室在 Nature 上【8】，同时报道了双敲除 miR-34和 miR-449家族能导致运动纤毛发生缺陷以及雄性小鼠不育， 而遗憾的是，当时两个实验室的研究人员均未意识到雄性小鼠不育是由于输出小管中的运动纤毛发生缺陷导致。两篇文章均认为是 miR-34/449直接影响小鼠精子发生，而导致了雄性小鼠不育的表型。幸运的是，在后续的研究中，闫威教授通过细心的观察敲除小鼠的表型以及对睾丸中生精细胞周期进行详尽分析，觉得 miR-34/449可能并不是直接导致精子发生障碍的首要原因。于是，闫威教授联系了伊利诺伊大学的 Rex Hess 教授，Rex Hess是世界上研究输出小管仅有的几个科学家之一，发表了一系列的有关输出小管功能研究的论文和综述。在2015年的美国SSR 年会上，当时还在闫威教授实验室做博后的袁水桥博士（现在已回到华中科技大学同济医学院计划生育研究所任教，本文第一作者），拿着部分数据找到了 Rex Hess教授，和闫威教授一起对课题进行了详细的分析与探讨，这才就有了这篇 PNAS 论文的故事。因此，这篇论文告诉我们，从事基础研究不但要有深厚的知识储备，更要有一颗发现真理的恒心，同时还要善于寻找合作，敢于否定之前的结论，最终发现生命的奥秘。

　　参考文献：

　　[1] Hess RA (2002) The efferent ductules: structure and functions. The Epididymis: from Molecules to Clinical Practice, eds Robaire B & Hinton B (Kluwer Academic/Plenum Pub -lishers, New York), pp 49-80.

　　[2] Hess RA (2018) Efferent ductules: structure and function. Encyclopedia of Reproduction, ed Skinner MK (Academic Press: Elsevier, San Diego), 2nd Ed Vol 1, pp 270-278.

　　[3] Clulow J, Jones RC, Hansen LA, & Man SY (1998) Fluid and electrolyte reabsorption in the ductuli efferentes testis. J Reprod Fertil Suppl 53:1-14.

　　[4] O'Callaghan C, Sikand K, & Chilvers MA (2012) Analysis of ependymal ciliary beat pattern and beat frequency using high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Cilia 1(1):8.

　　[5] Li S, et al. (2017) Estrogen receptor alpha is required for oviductal transport of embryos. Faseb j 31(4):1595-1607.

　　[6] Lechtreck KF, Sanderson MJ, Witman GB (2009). High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods Cell Biol. 91:255-64.

　　[7] Wu J, Bao J, Kim M, Yuan S, Tang C, Zheng H, Mastick GS, Xu C, Yan W. (2014) Two miRNA clusters, miR-34b/c and miR-449, are essential for normal brain development, motile ciliogenesis, and spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111(28):E2851-7.

　　[8] Song R, Walentek P, Sponer N, Klimke A, Lee JS, Dixon G, Harland R, Wan Y, Lishko P, Lize M, Kessel M, He L. (2014) miR-34/449 miRNAs are required for motile ciliogenesis by repressing cp110. Nature. 510(7503):115-20.