第二期赛默飞世尔科技质谱用户沙龙活动报道

　　2012年7月27日下午，由赛默飞世尔科技发起，分析测试百科网协办组织的第二期赛默飞世尔科技质谱用户沙龙在中科院遗传发育所成功举办。来自赛默飞世尔科技公司、北京出入境检验检疫技术中心、军事医学科学院、中科院遗传发育所的三十多位专家、学者出席了本次沙龙活动。

　　首先，来自赛默飞世尔科技CMD-MS市场经理王勇为博士作了题为《Thermo Scientific at ASMS 2012”（2012 美国质谱年会上赛默飞世尔科技动态）》的精彩报告。

赛默飞世尔科技CMD-MS市场经理 王勇为博士

　　王博士首先为大家简介了一下ASMS（美国质谱年会），他表示ASMS是一个学术水平很高、规模很大的会议，覆盖了整个质谱技术及其各个行业的应用，是非常值得参加的一个会议。是质谱界的“世界杯”

　　接下来，王博士介绍了赛默飞世尔科技在ASMS上的新产品和一些动态。王博士表示今年赛默飞世尔的主题是“应用创新”，寓意能够把产品发挥到最大的水平。在ASMS上，赛默飞世尔主要介绍了新产品在蛋白质组学、药物研发和食品安全等领域的应用。去年，我们推出了Orbitrap等其它高性能的一些产品；今年我们推出了台式的高分辨轨道阱、Exactive Plus Orbitrap、TSQ 8000的一台气质联用和TRACE 1300的一台气相色谱等新产品。

　　除此以外，还有一台用于蛋白检测的纳流分析仪——EASY-Spray nano LC。该仪器集成EASY-Spray™柱与EASY-Spray离子源，以及提供极易操作“plug-and-spray”纳升级LC-MS系统。不同于其它集成的纳升级LC-MS解决方案，它易于使用，高度可靠的EASY-Spray技术使色谱柱耐压可达1000 bar，用户可使用到小颗粒(2μm)色谱柱。

Thermo Scientific EASY-Spray纳升级LC-MS

　　

EASY-Spray™柱

　　

EASY-Spray离子源

　　王博士说到：“做仪器首先是要提高它的性能，然后是实现高通量，最后是想办法降低分析成本。这是我们这两年的目的。我们希望很多的产品能够实际应用到各个领域中。”

Exactive Plus系统

　　为了使更多的用户使用我们高端的产品，从产品规划上，赛默飞世尔有非常前沿的高端仪器，好的常规定量定性的能力，还有高通量的产品。其中高通量质谱中的Orbitrap Elite具有最大化的分辨能力，在m/z为400时高于240,000 FWHM；采用互补的碎裂技术，如碰撞诱导解离（CID）、电子转移解离（ETD）和 HCD时，该系统还可以获得更高的蛋白质序列覆盖率；可应用于自上而下的蛋白质组学的应用。Q Exactive具有140,000 FWHM的高分辨率；高性能的四极母离子选择；肽与小分子超级的定量能力。Exactive Plus具有140,000 FWHM的超高分辨率；快速扫描速度(频率)达到12Hz，与UHPLC快速色谱技术联用时可确保精确质量分析；全面升级的Q Exactive™高性能四极杆 -Orbitrap™ LC-MS/MS系统可实现预算和分析上的灵活性；质量范围扩展至50~6,000 m/z，可分析完整蛋白和单电荷离子。

　　另外，王博士对各种新仪器的应用也做了详细的讲解，结果证明赛默飞世尔的Orbitrap Elite、Q Exactive和Exactive Plus等新产品对食品安全、生物医药和环境检测等领域都有着很好的检测数据。

　　更多阅读：

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北京出入境检验检疫技术中心 刘鑫老师

　　来自北京出入境检验检疫技术中心的刘鑫老师带来的报告题目是《Orbitrap“双谱库”技术在食品安全领域的应用》。

　　刘鑫老师来自北京出入境检验检疫技术中心，该中心主要是做食品安全领域的应用课题的一些研究。刘鑫老师这次所讲的内容主要有高分辨质谱“双谱库”的建设；食品安全检测应用实例；谱库的拓展和基于服务器数据库的检索三大块。

　　高分辨质谱“双谱库”的建设

　　刘鑫老师首先介绍了“双谱库”的概念。“双谱库”是“高分辨质谱不对称双谱库技术”的简称，从食品安全检测实际出发提出的创新性技术方法，其包含筛查和确证。筛查即是高分辨质谱全扫描一级谱库，包括化合物分子结构、中英文名称、精确分子量参数、毒性信息、安全信息等；确证又是HCD高能裂解二级谱库。“双谱库”的优势也是非常明显的，高分辨质谱全扫描一级谱库既经济又高效，传统技术一次筛查数十个化合物，而“双谱库”可实现上万种化合物的筛查；HCD高能裂解二级谱库具有信息全和可移植性，能够提供高分辨的多级质谱裂解信息，并确证所用的裂解信息可以在类似仪器上实现共建共享。

　　接下来，刘鑫老师详细介绍了“双谱库”的建设：第一是筛查普库，目前已建立超过13000种化合物的筛查谱库，包括食品安全、公共安全领域等，涵盖农药、兽药、食品添加剂、工业染料、有毒物等等，具有信息全、可移植和自动化的特性；第二是确证谱库,目前已建立的HCD二级谱库已有106种化合物和848张HCD裂解谱图，检验中心近期又增加了数百个化合物的谱图（这些仍在整理中），并计划年底，二级谱库要达到800种化合物的HCD裂解谱图，确证普库具有碎片信息丰富、重现性高和自动化检索功能的特性。

　　食品安全检测应用实例

　　报告中，刘鑫老师列举了“双谱库”检测应用实例：一滴香中塑化剂的研究（有毒物的筛查），检测出很多增塑剂；蜂蜡中的添加物（人工添加物的检测）；市售猪肉样品中抗生素的研究（有目的的筛查与确证）；高分辨质谱对检测阳性样品的确证。双谱库筛查实验是由检验中心和赛默实验室合做的。实验证明检出率基本都在百分之九十以上。

Orbitrap“双谱库”食品安全检测流程

　　刘鑫老师总结了三重四极杆质谱用于多残留检测存在的问题：质谱分辨率不高，对一些分子量接近的化合物无法区分，即假阳性率高；对基质的干扰比较敏感，即样品前处理方法复杂；目标型检测模式，即仅目标化合物检测，不能对非目标化合物进行检测。而用市售猪肉样品中抗生素的研究和利用Orbitrap区分三聚氰胺干扰物质等事例进一步说明了“双谱库”检测方法分辨率高的优势。

　　谱库的拓展和基于服务器数据库的检索

　　最后刘鑫老师又阐述了谱库的拓展和基于服务器数据库的检索(主要是对假阳性的判断及鉴定)。所采取的措施是，一、整合网络数据库，进一步扩大数据库检索能力;二、尽可能多的检出食品中包含的化合物;三、对未知物进行鉴定。刘鑫老师又列举一些“80万种化合物谱库”应用实例，包括1、假阳性干扰物的确证和未知物的结构解析;2、一滴香中未知化合物的解析。

　　刘鑫老师最后说道“我们希望给造假者一种威慑力，告诉他们我们有这样实力，能够去检测”。

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军事医学科学院六所 李敬来老师

　　来自军事医学科学院六所的李敬来老师作了题为《苯环壬酯手性对映体体内拆分与立体选择性动力学研究》的报告，主要从研究背景、研究目的、研究方法上介绍了8021消旋体在比格犬体内测定拆分方法的建立过程。

　　实验室基本介绍

　　李老师首先为我们介绍了军事医学科学院药物代谢与药代动力学重点实验室的基本情况。实验室组建于六十年代，在“十五”、“十一五”“十二五”期间获得了国家科技部“863”重点项目基金和重大新药创制资助，是国内四家全面提升药物代谢平台建设之一，在2004年和2006年获得了北京市科委和国际合作项目的资助，建立了早起药物代谢性质快速评价的体系;2009年到2010年承担了117项新药系统评价的临床项目，其中包括53项重大新药创建资助服务的项目。目前实验室拥有LC-MS10台、GC-MS2台、HPLC多台、专门用于生物技术药物代谢研究的毛细管电泳仪和定量PCR仪以及配套的放射性同位素实验室设备。实验室目前的技术优势

　　在国内最早开展了生物技术药物的药代动力学研究，承担了国内大部分的生物技术药物的药代评价任务。在国内率先采用巨型计算机和VolSurf软件预测待合成、筛选化合物的细胞膜透性、P-糖蛋白外排及蛋白质结合等体内转运过程。建立多种体内、体外药代实验模型和快速评价技术，配合药物设计开展化合物成药性预测。在国内最早利用配套的放射性同位素实验设备开展研究药物的组织分布。拥有一个新药研究多学科合作群体，为药代动力学研究提供了强有力的技术支持。

　　研究背景

　　苯环壬酯(8021)是研发的创新结构的M受体拮抗剂，消旋体为国家I类新药被批准上市，主要用于抗晕动药。大量的实验研究发现，L-8021在可逆性胆碱酯酶一只鸡引发的免逆向转圈综合征和猫运动病样综合征两种动物运动病模型上，左旋体比消旋体具有更好的抗晕效果。进一步的药理学基质研究表明其活性异构体为左旋8021，右旋体无效。开发手性药物的光学异构体，能够提高药效，降低对毒副作用。因此，对手性药物的单一光学异构体的开发研究已经成为新药研究的重要内容。

　　研究目的

　　(1)根据SFDA对已上市消旋体开发单一对映体的要求，建立体内手性对映体拆分和定量测定方法，测定优映体转化为另一对映体的程度是否显著，研究优映体单独用药是否与作为外消旋体组分时的药代动力学性质一致。

　　(2)比较手性对映体的代谢差异性。

　　(3)为药效和地理学提供参考依据，逐渐积累手性药物代谢研究经验。

　　8021消旋体在比格犬体内测定拆分方法的建立

　　李老师介绍从色谱柱、有机溶剂及比例、缓冲溶液及比例、温度四个方面摸索了拆分方法的建立过程。

　　手性色谱柱包括有7类：“刷型”手性固定相(CHIRALPAK AD-RH)、手性聚合物固定相(CHIRALPAK AS-RH)、环糊精类固定相(CHIRALCEL OD-RH)、大环抗生素固定相(CHIRALCEL OJ-RH)、蛋白质固定相(ULTRON ES-OVM)、配体交换固定相、冠醚固定相。经过比较最终选择了蛋白质类的手性柱ULTRON ES-OVM作为固定相。

　　有机溶剂种类对分离度的影响：研究发现将常用的有机溶剂甲醇、乙腈与水混合作为流动相时，均不能获得良好的效果，而用乙醇、异丙醇时可以得到较好的分离。

　　有机溶剂的比例对分离度的影响：在手性拆分时对有机溶剂的要求比较高，因为比例的变化范围比较窄，有机相的比例越低在手性柱上的保留时间会越长，研究中发现当乙醇比例在16%时分离效果最好。

　　有机添加剂(缓冲液)种类和比例对分离度的影响：在使用5mM磷酸氢二钠和5mM乙酸铵作为缓冲液进行分离的时候比较发现，采用5mM的乙酸铵可以达到较好的效果。

　　温度对分离度的影响：升高色谱柱温度会使峰形变得锋利，缩短分析时间，但是会降低分离度，因此需要稍稍降低色谱柱的温度。

　　研究结果

　　考察了手性固定相、有机溶剂种类和比例、缓冲溶液种类和浓度对对映体拆分的影响，建立了生物样品中8021手性异构体分离定量方法，为手性药物立体选择性动力学研究提供了方法学基础。

　　实验结果证明8021优映体在动物体内均不发生构型转化，阐明了药效作用手性物质基础就是优映体本身。

　　8021以外消旋体形式用药时，右旋体的吸收程度明显高于左旋体，并抑制左旋体的吸收，左旋体单独用药时吸收程度明显高于消旋体给药，开发左旋体能增加药效并且降低副作用。

　　采用LC/MS/MS和GC/MS分析鉴定手段，结合稳定性同位素掺入技术，8021左旋体和消旋体在大鼠体内均发现11个代谢产物，其中4个结构与以往相同，7个为新发现产物。大鼠灌胃给药8021左旋体和消旋体后，代谢产物基本一致，但代谢产物量上有明显差异。

中科院遗传发育所 刘科辉 老师

　　来自中国科学院遗传与发育生物学研究所的刘科辉老师作了《Orbitrap Elite在翻译后修饰蛋白质组研究中的初步应用》的精彩报告。

　　中科院遗传与发育所概况

　　2001-2003年经由原中国科学院遗传研究多、发育生物学研究所及石家庄农业现代化研究所整合而组成，构建有植物基因组学国家重点实验室、植物细胞与染色体工程国家重点实验室、分子发育生物学国家重点实验室和河北省节水农业重点实验室。遗传发育所瞄准农业可持续发展和人口健康的归家重大战略需求，针对重要农艺性状分子机理、细胞分化与器官发育、生物分子网络、动植物品种设计以及农业资源高效利用等领域的关键科学问题，开展原始创新和继集成创新研究，提出和发展具有重大影响的科学理论和概念;建立和完善动植物品种分子设计和培育的方法，重要遗传疾病研发以及农业资源高效利用的技术体系。

　　目前实验室配备的研究蛋白质的仪器设备包括LTQ-Orbitrap-Elite、TripleTOF 5600、Autoflex MALDI-TOF等。

　　蛋白质组学的介绍

　　蛋白质组的研究与其他的小分子的研究有点区别，后者主要是发现和研究大自然中已经存在的对象，前十年的研究中蛋白质组学致力于由蛋白质根据中心法则寻找对应基因的库的建立，目前的重点在于研究在有基因转录翻译成蛋白质的过程中会发生很多的修饰，而这些修饰才是执行生物功能的关键，研究这些修饰是对蛋白质组学研究的一项挑战。

　　翻译后修饰的认识

　　翻译后修饰是翻译后的化学性修饰，在功能性蛋白质的合成中发挥着重要作用，通常是来调节细胞活动的，能够发生在蛋白质生命周期的任何一步，蛋白质的翻译后修饰在蛋白质性质的修饰上是可逆的，存在有200多种翻译修饰的酶，包括激酶、磷酸酶、转录酶和连接酶等。

　　翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化、类泛素化、硝基化、乙酰化、酯化等修饰。

　　Orbitrap Elite组合式质谱仪

Thermo Scientific Orbitrap Elite组合式质谱仪结构

　　刘老师所在课题组利用Orbitrap Elite组合式质谱仪的特点，针对着以上翻译后的修饰进行了许多工作。Orbitrap Elite组合式质谱仪的特点是各个模块、各种参数均可以调节，通过利用各种不同的方法来优化这些参数以达到鉴定的目的。Orbitrap Elite以MSA的方式进行工作，在做磷酸化修饰时肽段上的磷酸根容易发生作用丢失，发生作用丢失后在普通的裂解方式中就会很难检测到磷酸根，MSA的工作方式保证了在磷酸根丢失后可以自动调整打碎的能量，最后得到打碎前后峰图的比较，从而提高了磷酸化鉴定的效率，在得到谱图后可以根据谱图上显示的分子量匹配出相应的氨基酸序列，由氨基酸序列在蛋白库中找到蛋白质。例如在做泛素化的时候，本身作为一个肽段，需要连接到目的肽段上去，导致分量很大，此时就需要高能裂解HCD的方式去将之打碎，这是Orbitrap所特有的。

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