淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

细胞融合前准备
　　　　细胞融合，选择杂交瘤
　　　　抗体的检测
　　　　杂交瘤的克隆化和冻存
　　　　单克隆抗体的大量生产
　　　　单克隆抗体的鉴定
　　　　影响因素、失败原因分析

---

　　一、细胞融合前准备

　　（一）　免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

　　1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射）

　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后

　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip

　　　　　　　　　　　　↓　3周后

　　　　　　　　　　加强免疫（融合前三天）　1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）

　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　取脾融合

　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　　　　　　　│　　　　　（一般0.8～1ml　0.2ml／点）

　　　　　　　　↓3周后

　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　　　　　　　│　　　　　　　（ip剂量不宜超过0.5ml）

　　　　　　　　↓3周后

　　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip

　　　　　　　　│ （5～7天后采血测其效价，检测免疫效果）

　　　　　　　　↓2～3周后

　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　　　　　　　↓3天后

　　　　　　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　（二）　饲养细胞

　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　　　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备

　　　　　小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

　　　　　　↓

　　　　　拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

　　　　　　↓

　　　　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　　　　　↓

　　　　　用无菌注射器注入6～8ml培养液

　　　　　　↓

　　　　　反复冲洗，吸出冲洗液

　　　　　　↓

　　　　　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

　　　　　　↓

　　　　　用20％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　　　　　↓

　　　　　加入96孔板，100μl／孔

　　　　　　↓

　　　　　放入37℃　CO₂孵箱培养

　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×10⁶腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×10⁶／ml，小鼠脾细胞为1×10⁶／ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1×10⁵／ml，均为100μl／孔。

　　（三）　骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量　McAb。

　　常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

　　骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的zui大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

　　一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

　　保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。

　　（四）　免疫脾细胞

　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取zui后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

　　脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。

　　二、细胞融合，选择杂交瘤

　　（一）　细胞融合流程

　　（1）　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　（2）　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

　　（3）　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

　　（4）　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

　　（5）　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

　　（6）　在室温下融合:

　　①　30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO，边加边搅拌。

　　②　作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

　　③　加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

　　（7）　离心，800rpm，6分钟。

　　（8）　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

　　（9）　根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

　　（10） 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO₂孵箱培养。

　　一般一块96孔板含有1×10⁷脾细胞。

　　（二）　HAT选择杂交瘤

　　应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

　　一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后zui初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。

　　50×HAT

　　H:　5×10^-3M

　　A:　2×10^-5M

　　T:　8×10^-4M

　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

　　三、抗体的检测

　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

　　3.　FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

　　4.　IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

　　上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存

　　克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

　　（一）　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

　　1.　有限稀释法的程序

　　①　制备饲养细胞悬液（同融合前准备）

　　②　阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

　　③　取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

　　④　培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。

　　⑤　第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

　　注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

　　2.　软琼脂法

　　①　软琼脂的配制

　　含20％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640