原位杂交组织化学杂交前处理

杂交前处理的目的在于提高组织通透性。增加靶核酸的可及性以及防止RNA或DNA探针与组织细胞或载玻片之间的非特异性结合，从而增强杂交信号，降低背景。杂交前处理的具体方法和步骤因所采用的固定剂、组织标本以及探针不同而异。用温和的非交联固定剂固定的细胞培养标本和冰冻切片，不需经特殊的杂交前处理，一般均能获得较好的杂交反应结果。而用交联固定剂固定的标本。尤其是福尔马林固定的石蜡切片．则需经杂交前处理才能获得较好的结果。杂交前处理主要包括增强组织的通透性和核酸探针的穿透通性，减低背景染色两个方面。

    （一）增强组织通透性和核酸探针穿透性

    对于用戊二醛等强交联固定剂固定的组织，由于固定剂与蛋白质产生广泛交联，需要应用较强的增强组织通透性的试剂。增强组织通透性常用去污剂或某些消化酶处理．通过这种处理可广泛除去蛋白质而增强组织的通透性和探针的穿透性，提高杂交信号．但同时也会降低RNA的保存量?影响组织结构的形态，导致标本从载玻片上脱落，因此在用量和时间上应加以注意。

    1．去污剂处理  常用去污剂为TritonX-100，一般将切片浸入含0．2％～0．5％Triton X—100的PBS内处理15分钟。

    2．蛋白酶处理  蛋白酶K的消化作用在原位杂交中十分重要。其浓度及孵育时间视组织种类、固定剂种类、切片厚度而定，一般应用蛋白酶K 1ug／m1（于0．1rnol／L Tris，50mmol/L EDTA，pH8．0缓冲液中），37~C孵育15～30分钟，以达到蛋白充分消化作用而不影响组织形态为目的。蛋白酶K还具有消化靶DNA周围蛋白质从而提高杂交信号的作用。在蛋白酶K消化后，用蛋白酶K抑制剂终止反应，即在冷PBS中清洗及在含0．2％或0．1mol／L甘氨酸的PBS中清洗。为保持组织结构，通常用4％多聚甲醛再固定3～5分钟。石蜡切片在此之前必须先脱蜡．并经下行酒精入水。

    （二）减低背景染色

    1．酸酐和稀酸处理  为了防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合?降低背景，杂交前标本可用0．2；％醋酸酐处理10分钟。经醋酸酐处理后，组织中蛋白的碱性基团通过乙酰化而阻断，使蛋白质的等电点偏向酸性，从而抑制非特异性吸附。组织和细胞标本也可在杂交前用稀酸（如0．2mol／L HCl 10分钟）处理。稀酸处理能使碱性蛋白变性，如再结合蛋白酶消化。即可将碱性蛋白移除．这样不仅能增强靶核酸探针的可及性，也可避免碱性蛋白与核酸之间的非特异性结合．达到降低背景的目的。

    2．预杂交  预杂交是指在杂交前用不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本1—2小时，以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景染色的目的。预杂交是减低背景染色的一种有效手段。

    3．内源性生物素和酶的抑制  非放射性原位杂交，如用生物素、HRP或AKP做标记物，组织中内源性的生物素、过氧化物酶或AKP则应事先阻断。当对含有内源性生物素较 丰富的组织（如肝和肾组织）用免疫细胞化学ABC法检测杂交反应时，标本可先用未标记的卵白素—生物素孵育?以阻断内源性生物素。适宜的杂交前蛋白酶消化有利于消除内源性生物素的干扰。用5％脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的亲和素以及将标本浸于含2％牛血清白蛋白的缓冲液，均可防止或抑制标记的亲和素与组织标本之间的非特异性结合。对于内源性的AKP和过氧化物酶可通过将标本分别浸于20％醋酸（4C）中15秒或0．019g／L过碘酸淋洗和用含1％H₂O₂的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育30分钟加以阻断。