SAGE(Velculescuetal.1995) 是基于 PCR 技术的一种高灵敏度研究基因表达的方法,可得到 mRNA 文库的定性及定量信息。自 1995 年此技术产生以来,发表了大量的相关文章,表明 SAGE 可同时检测大量基因的表达水平的变化。
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、一般原则若用于 SAGE 的 RNA 有足够的量,最好用 2.5~5 ug polyA+RNA, 可按实验方案 A 进行。这里我们还提供了实验方案 B,它在多个步骤上已做了修改,适用于仅有微量的原材料(例如,利用这个流程我们能从来自于 300fxm 脑切片的海马样品中获得基因表达谱)。后一实验方案尤适用研究神经组织表达,由于其复杂的神经环路及高度特化的结构,获得大量均质组织以分离 RNA 往往是不可能的。 下面对两组实验方案第 1 步到第 8 步进行了详细的描述,从第 9 步起两组方案步骤相同。 二、mRNA 的分离实验方案 A许多试剂盒分离 PdyA+RNA 的效果都很好,我们推荐使用 mRNADIRECT 试剂盒(Dynal;610.11) 来从组织中或培养的细胞中分离 polyA+RNA,或者用 mRNA 纯化试剂盒(Dynal;610.01) 从总 RNA 中分离 pdyA+RNA。在试剂盒说明书中对所有步骤有详细的描述。 实验方案 B1.TRIzol 分离总 RNA(见 DD 实验方案)。 2.在 RNA 沉淀后,将 1~10 吨总 RNA 重悬于 20 ul 裂解缓冲液中(mRNA 捕获试剂盒)。
3.稀释 20X 生物素化的 oligo(dT)20 引物(mRNA 捕获试剂盒)到最终浓度为 5Pmol/ul。 4.将 4 ul 稀释的引物加入到含有 RNA 的裂解缓冲液中。 5.在 37℃ 退火 5 min。 6.转移 RNA 到一个链霉抗生物素包被的 PCR 管中(mRNA 捕获试剂盒)。 7.在 37℃ 保温孵育 3 min(在此步中通过链球菌素-生物素结合 mRNA 被固定于试管壁上)。 8.移去管中溶液(含有未结合的 RNA 片段:rRNA、tRNA 等),用 50 ul 洗液小心地冲洗试管 3 次(mRNA 捕获试剂盒)。 9.去除洗液。 10.立即进行 cDNA 合成步骤。 三、cDNA 合成实验方案 A1.以 oligo(dT)-引物加入 2.5~5 ug polyA+RNA 合成 cDNA。 2.在 0.5 mlPCR 管中混合(冰上操作): —2.5 ul polyA+RNA(1 ug/ul) 一 4 ul 5X 第一^缓冲液 —2 ul 0.lmol/LDTT —1 ul 10 mmol/LdNTPs 一 1 ul oligo(dT)18(生物素化的)(0.5ug/ul) 一 1 ul SuperScriptHRT(200ug/ul) —8.5 ul DEPC 水 总体积为 20 ul。 3.42℃ 孵育 2 h(可在 PCR 仪中进行)。 4.在冰上加单链 cDNA 进行第二链合成: —(20 ul 单链 cDNA) 一 16 ul 5x 第二链缓冲液 —1.6 ul 10 mmol/LdNTPs —2 ul DNA 多聚酶 I(10u/ul) —1 ul T4DNA 连接酶(5u/ul) —1 ul RNase H(5u/ul) 一 38.4 ul 重蒸(馏)水 总体积为 80 ul。 5.在 16℃ 孵育 2 h。 6.用 LoTE 扩容至 200ul。 7.加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)(PCI)。 8.振荡。 9.在 4°C 微量离心机中以 13OOOr/min 离心 5 min。 10.转移上层水相至一新 1.5 ml Eppendorf 试管中。 11.乙醇沉淀: —3 ul 糖原 一 100 ul 10 mmol/L 乙酸铵 一 700 ul 乙醇 12.置于-20°C 下 30 min。 13.在 4”C,在微量离心机中以 13OOOr/min 离心 15 min。 14.以 500 ul 70% 乙醇有力振荡冲洗沉淀两遍。 15.去除 70% 乙醇,让沉淀物在空气中风干约 15 min。 16.将沉淀重新悬浮于 20 ul LoTE 中。 实验方案 B
1.用 50 ul 1 第一链缓冲液冲洗捕获 PolyA+RNA 的试管,然后移去缓冲液。 2.用下述步骤代替 IX 第一链缓冲液(在冰上移液): —4 ul 的 5X 第一链缓冲液 一 2 ul 的 0.1mol/L TT 一 I ul 的 10 mmol/LdNTPs 一 1 ul 的 SuperScriptII RT (200 U/ul) —12 ul DEPC 水 总体积为 20ul。 3.42℃ 下孵育 2 h(在 PCR 仪进行)。 4.从试管中移去反应混合物,并以 50 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次 (mRNA 捕获试剂盒)。 5.移去冲洗液,用 5 〇 4 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次。 6.用下述溶液替代 IX 第一链缓冲液 一 4 ul5X 第二链缓冲液 _0.4ul 的 IOmmol/LdNTPs —Iul DNA 多聚酶 I (10 U/pl) —0.5ulT4DNA 连接酶(5U/-) —0.5ul RNaseH(5U//^l) —13.6 ul 蒸馏水 总体积为 20ul。 7.在 16℃ 下孵育 2 h。 双链 cDNA 可保存于-20℃, 或者直接在下一步中应用(以锚定酶消化 cDNA)。 |