BAC／PAC文库的构建

EcoRⅠ消化的基因组DNA载体DNA电转化感受态细菌细胞

5 X 缓冲液EDTA蛋白水解酶KPMSF 缓冲液Not I 限制酶和缓冲液琼脂糖溶液0.5 X TBE 缓冲液

SOC 培养基LB 平板LB 培养基水浴锅激孔透析膜离心管轨道混合器自动质粒隔离系统软质塑料96孔板

1.目标区域的大小

（1）如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。

（2）如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。

（3）如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来完成。

2.筛选文库的难易程度

黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。

3. 载体拷贝数的考虑

当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。这个矛盾常常困扰着研究者。而EPICENTRE's CopyControlTM 克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。

四、将基因组DNA片段连接入载体

使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。连接反应体系以100ul为宜。

注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。

五、将重组载体转入宿主细胞

1. 如果使用Epicentre试剂盒构建黏粒文库，需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染Epicentre EPI300-T1?Plating Strain。挑出重组子，鉴定插入片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话，就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。

2. 如果使用Epicentre试剂盒构建BAC文库，应选择电转法，可以选择Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作为宿主，将上述连接产物转入细菌，涂板长出克隆后。获得克隆，研究者需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。Epicentre 文库构建试剂盒中的EPILyse和EPIBlue，快速裂解克隆并电泳，可以方便的鉴定出BAC克隆的大小，从而估计出BAC文库的大小。如果文库大小合适，那么这个文库就可以进行后续的操作了。

六、文库克隆数的确定

基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：

N = ln （1-P ） / ln （1-f ）

P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。

举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为：

N = ln （1 - 0.99） / ln （1 - [106bp / 3 x 109 bp]） = -4.61 / -3.33 x10^-6= 138,298