T7RNA聚合酶／启动子表达实验2

蛋白质

氨基酸混合物M9培养基甲硫氨酸甲醇

荧光显微镜离心机分光光度计

1.  将含有待表达基因的片段亚克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，转化一种标准大肠杆菌菌株，此菌株不应带有可指导T7 RNA聚合酶合成的质粒。转化物涂布于氨苄青霉素平皿，于37℃温育培养过夜。

2.  挑取独立的转化菌落于LB/氨苄青霉素培养基中，37℃培养，通过小量制备方法获得质粒DNA。以限制性酶谱分析确证基因正确插入与否。 
 

3.  从pGP1-2转化大肠杆菌K38株涂布LB/卡那霉素平皿上，30℃下培养过夜（24 h）。挑取单个的转化菌落于LB/卡那霉素培养基中，30℃培养。

4.  将一含有P_t7控制下的待表达基因的载体转化入大肠杆菌K38/pGP1-2，于LB/卡那霉素培养基上生长（转化期间细胞可经热激处理），将转化物涂布于LB/氨苄青霉素/卡那霉素平板上，30℃培养过夜。

5.  当OD₅₉₄≈0.4时，取1 ml 细胞，微量离心10 s。弃上清。

6.  用1 ml M9培养基洗细胞沉淀，室温下离心10 s，弃上清。

7.  用1 ml 含18种氨基酸混合物的M9培养基重悬细胞沉淀，30℃振荡培养60 min。
 

8.  细胞于42℃温育20 min，以诱导T7 RNA聚合酶，加20 mg/ml 的利福平至终浓度为200 μg/ml，然后将细胞再置于42℃温育10 min。
 

9.  将细胞移入30℃水浴中，放置20 min，取0.5 ml 细胞用于［³⁵S］甲硫氨酸标记（另外的0.5 ml 可在以后的时刻用作标记）。
 

10.  加入10 μl［³⁵S］甲硫氨酸于0.5 ml 细胞液中以标记新合成的蛋白质，30℃下温育5 min。

11.  离心10 s，弃上清，（注意：上清是有放射性的，应妥善处置。）用100 μl 裂解液重悬细胞。

12.  样品100℃加热5 min，取20 μl 加样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶中并进行电泳。

13.  用荧光显影增强剂处理凝胶，65℃下真空干燥凝胶2 h，进行放射自显影。