1.如实验方案6所述裂解细胞。 2.4°C 条件下23000 g离心细胞裂解液30 min。 3.倒出上清,测定沉淀的湿重。 4.用约 10倍体积的洗涤缓冲液重悬沉淀,室温搅动悬浮液lh。 5.4°C条件下23000 g 离心混合物30 min。 6.除去上清,并重悬沉淀。 7.重复4~5步骤3次以上(直到重组蛋白的纯度>80%,用分析级 SDS-PAGE 来判断)。 8.溶解步骤7的沉淀物,每克湿重沉淀(由步骤3决定)加人约 8 ml 的溶解缓冲液,在 4°C条件下温和搅动混合物 16~20 min。 实验提示:蛋白浓度不要超过 2~3 mg/ml
其他的溶解缓冲液: (1)8mol/L 盐酸胍,10 mmol/L DTT,50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 每 12~15 g 湿重的收集细胞用 15 ml 溶液溶解。37°C 孵育混合物 1h (Weir,et al,1987)。如步骤9(1) 所述变性蛋白。 (2)8mol/L脲素,2 mmol/L 还原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽。 每克湿重包含体沉淀使用 9 倍体积的缓冲液。室温孵育混合物 lh。蛋白浓度不要超过 2.5 mg/ml(Bollag,et al,1996)。如步骤9(2) 所述复性蛋白。 9.特定目的蛋白的重新折叠所需的最适条件必须通过预实验来选择。复性条件包括: (1)用 1.5/mol/L 硫酸铜、50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 溶液将可溶性沉淀稀释 25 倍,至终浓度为0.04 mol/L DTT、0.24mol/L 盐酸胍和约1.4 ug/ml 的目的蛋白(Weir,et al,1987)。20°C 孵育混合物 2 h。 (2)缓慢将 9 倍体积的 50 mmol/L 磷酸盐、50 mmol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA(含 2 mmol/L 还原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽)加人溶解的沉淀中。25°C 孵育混合物 2?4 h。 10.用适合于目的蛋白的浓缩步骤来回收重折叠的蛋白(如 RP-HPLC、冻干或超过滤)。 展开 |