固相化pH梯度双向凝胶电泳实验11

在方案 11 中介绍的银氨方法是用于检测在 SDS-PAGE 凝胶上蛋白质的最灵敏的方法之一。但是，这种方法和其他标准银染方法都不适合于质谱分析，而质谱已成为鉴定双向凝胶上蛋白质的最好方法。因为在凝胶中被质谱分析的蛋白质不能被修饰，许多通常用的敏化试剂（例如戊二醛和强氧化剂）不能使用。而且，研究者发现购买专用试剂盒有很多优点，因为其中的试剂质量对完成银染是有保证的。这样的试剂盒可从不同公司购得，如 Amersham Biosciences、Bio-Rad、Piece 等化学试剂供应公司。此处介绍的方法是基于 Yan 等描述的 Amersham Biosciences Plus One 银染试剂盒 (2000b)。他们发现这个方法适合 MALDI 和 ESI-MS 质谱，与其他银染方法（包括方案 11 中叙述的方法）相比，此法可处理少量制备样品且没有负染色效果。但是，这个过程与标准银染法相比灵敏度不够高。与 MS 兼容的银染方法，见 Shevchenko 等（1996)、Scheler 等（1998)、Gharahdagh 等（1999) 和 Sinha 等（2001)。

包含蛋白质样品的凝胶

显色液固定溶液敏化溶液银染溶液终止液

塑料纸或细长的聚碳酸酯塑料薄片玻璃或塑料平皿往复式或定轨式摇床

1.将凝胶放在含 250 ml 固定液的平皿中，在摇床上摇动 5 min。如果有多块凝胶要固定，应在单独的平皿中染色。

2.从平皿中排尽固定液，用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。不允许戴手套的手直接和凝胶接触。再加 250 ml 固定液，继续摇 15 min。

3.弃去固定液，在平皿中再次加人 250 ml 敏化液，在往复式或定轨式摇床上摇动 30 min。

4.从培养皿中排尽固定液，在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶，加足够董的去离子水来覆盖凝胶。在摇床上摇动凝胶 5 mm。

5.排尽水，重复水洗 2 次以上。

6.在步骤⑦之前 30?60 min 制备银染溶液。

对 4 个标准大小的凝胶，IL 银染溶液是足够的。

7.排尽平皿里的水，支持凝胶在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸醋薄片。在每个平皿中加 250 ml 银氨溶液在往复式或定轨式摇床上摇 20 min，摇动时间可缩短至 15 min。如有必要，应至少 15 min，不超过 20 min。

8.将银氨染色溶液倒人一个合适的废物缸中，确保不用戴手套的手接触凝胶。

9.加足够的水来覆盖凝胶。在摇床上摇 5 min。

10.排尽水，将第一次洗液倒入盛有硝酸银的废物缸。重复用 H2O 洗 2 次以上。

11.当洗凝胶时，制备显色液和终止液。将终止液放在易操作的位置以避免显色和终止之间的延迟。

12.从平皿中排尽水，在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。在培养皿中加 250 ml 反应液。在放有白纸的摇床上摇动。

白纸可提高被染色蛋白和背景之间的反差，提高决定反应终止点的准确度。

实验提示：一次不要同时显色 3 块以上的凝胶。准备显色凝胶之前在 H2O 中保存其他凝胶。合适的显色时间随每块胶的不同而不同。单独观察凝胶决定显色终止的合适时间。当蛋白质点出现黑色或小的蛋白质点变明显时，这一时间是较合适的。第一个蛋白质点出现约需 lmin。注意不要过度显色。合适的时间通常约为 5~lOmin。

13.当凝胶充分显色后，将显『色液倒人合适的废物缸内。在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶，快速将 250 ml 终止溶液倒人平皿中，在摇床上摇动 IOmin0

14.弃去终止液，用 H2O 覆盖凝胶，在摇床上摇动 5 min。

15.倒掉水，重复水洗 2 次以上，准备对凝胶进行扫描分析或质谱分析。

实验提示：Gharahdaghi 等（1999) 曾报道，在凝胶消化前，脱色以除去银颗粒可能会提高质谱的效果。