固相化pH梯度双向凝胶电泳实验14

包含蛋白质样品的凝胶

转移缓冲液

印迹纸硝化纤维素薄膜或 PVDF 膜电源电泳转移设备

1.测量 SDS-PAGE 凝胶的尺寸，将转移膜剪成与凝胶相适应的尺寸。

槽式转移系统的膜根据需要可以剪成比凝胶大或者小。

2.用水将薄膜润湿或用甲醇将 PVDF 膜润湿。操作要小心，以避免膜不平整及膜下面产生气泡。

3.将湿润的薄膜转移到一个盛有转移缓冲液的平皿中，使膜在其中平衡 5 min。

4.将印迹纸剪切成合适大小，按照转移设备的指导手册进行操作。

5.将印迹纸、凝胶和膜排列成「三明治」状，避免在任何层之间产生气泡。这是很关键的，因为气泡可阻止相关位置蛋白质的转移。最好按以下（1）~（8）的说明进行操作：

（1）将转移盒放人盛有转移缓冲液的平皿中。

（2）将泡沫海绵放在转移盒里，挤压走所有气泡。

（3）将印迹纸的一层放在海绵的上面，以保证其完全湿润和平整；在印迹纸上来回滚动玻璃棒以赶走气泡。

（4）将双向凝胶放在印迹纸表面，排列整齐，通过滚动的玻璃棒赶走所有的气泡，但要小心不要在凝胶上施加太多的压力。

（5）将转移膜放在凝胶上方，注意一开始应将膜放在准确的位置，在凝胶上移动膜通可能引起污迹；用滚动的玻璃棒去除膜与凝胶之间的气泡。

（6）将另外一张印迹纸放在膜上，确保它湿润、平整；通过滚动玻璃棒去除印迹纸表面的气泡。

（7）将泡沫海绵放在转移盒中，挤压走海绵中的气泡。

（8）盖上转移盒的盖子。

6.对其他每块要进行电泳转移的凝胶重复步骤5。

7.在转移盒中装人 2/3 体积的转移缓冲液。

8.将转移盒放入转移槽中。

实验提示：确保线路连接正确以便使蛋白质从凝胶转移到膜上，而不是从凝胶到印迹纸，最后到溶液中。

9.在转移单元中加转移缓冲液以确保所有的转移盒浸没在缓冲液中。

10.将盖子放在转移槽上，使正极（红）接近于膜而不是凝胶。

使在电泳期间，使凝胶上的蛋白质从负极（黑）迁移到正极（红）。

11.如果转移进行 lh，将循环水浴和热交换系统相连，温度设置在 15°C。

这种转移设备在高电流条件下使用，如没有有效的冷却设备，将会损坏转移设备。循环水浴将能保持转移过程中的温度。

12.按照操作指导手册建议的时间和电流进行转移。

13.当完成转移时，停止水浴，关掉电源。打开盖子，移出转移盒。

14.卸下转移盒里的海绵、印迹纸、膜、凝胶。用去离子水洗净海绵，在空气中瞭干以备下一次使用。用软铅笔来标记对着凝胶的膜面的一边。

不要用钢笔或记号笔，因为墨水会溶解在浸膜所用的缓冲液中。

15.对膜进行染色或处理印迹（参见方案 17~20)，或将膜置于印迹纸之间，于黑暗处干燥保存。

如果干燥保存，在染色之前，必须用水（硝酸纤维素薄膜）或甲醇 (PVDF 膜）重新湿润。