一、蛋白质印迹法蛋白质印迹 (Western Blotting) 法是在混合的复合物中鉴定和定量特定蛋白质的一种有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。这一技术对固定在硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯 (PVDP) 膜上的蛋白质样本进行非直接的检测。在常规的蛋白质印迹中，蛋白质样本首先通过 SDS-PAGE 进行分离，然后电转移到膜上。在用不相关的蛋白质封闭膜之后 ，用与靶抗原结合的一抗 (多克隆抗体或单克隆抗体) 与膜孵育。接着清洗膜，再用可与一抗发生反应的酶联二抗孵育。然后再次清洗膜，将其在合适的酶底物中孵育。如果使用比色底物的话, 信号可以目测，如果用化学发光和荧光底物，则 可 利 用 X 射线胶片或成像设备测得信号。 蛋白质印迹方法学中几个最重要的进步包括高灵敏度增强化学发光底物、成像系统和最近出现的多种见光稳定的荣光剂= 超尚灵敏度的化学发光底物 的广泛应用几乎取代了同位素标记的探针的使用。用125I 标记的蛋白质 A 或蛋白质 G 曾一度广泛用做二级检测剂，但如今增强化学发光底物就可检测到低至飞克 (femtogram) 数量级的蛋白质，并且具有高信噪比。 电荷親合元件 (charged-coupled device，CCD) 成像仪在大多数实验室中都十分常见。成像仪具有较大动态范围和高程度曝光控制, 这使得背景信号能够自由调节。此外 ，成像仪所附带的分析软件能够完成光密度分析。尽 管 X 射线胶片仍然应用广泛且灵敏度更高，但 是 CCD 成像系统却可以避免处理胶片和显影的麻烦，并且也不会产生化学废物。 近 来 ，荧 光 剂 染 料 发 展 迅 速 ，这 要 归 功 于 新 一 代 荧 光 团 。与 传 统 荧 光 团 相 比 ，它 们 在亮 度 、光 稳 定 性 及 p H 灵 敏 度 上 有 着 巨 大 的 进 步 。通 过 荧 光 检 测 的 蛋 白 质 印 迹 检 测 法 通常 用 于 同 一 印 迹 中 需 要 检 测 两 种 不 同 靶 抗 原 时 。而 突 光 团 对 的 选 择 基 于 它 们 不 同 的 可 区分 开 的 激 发 -发 射 光 谱 。易 辨 别 的 颜 色 差 异 能 够 使 多 色 检 测 实 验 顺 利 完 成 。最 值 得 注 意的 是 ，这 些 新 型 荧 光 染 料 结 合 软 件 的 运 用 ，可 实 现 细 胞 信 号 通 路 的 检 测 和 定 量(Chou d h a r y et al ,2007；T i p s m a r k et al. ,2008) 二、蛋白质印迹法的种类2.1 直 接 与 间 接 直 接 蛋 白 质 印 迹 法 是 指 利 用 标 记 报 告 系 统 的 一 抗 直 接 与 靶 蛋 白 结 合 。间 接 蛋 白 质 印迹 法 则 利 用 标 记 的 二 抗 (R a m L a U ，1987) 与 未 标 记 的 一 抗 相 结 合（图 33. I h 由 于 无 需 与二 抗 孵 育 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 比 间 接 蛋 白 质 印 迹 法 耗 时 较 短 。此 外 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 也避 免 了 因 二 抗 交 叉 反 应 所 造 成 的 背 景 信 号（Bergendahl et al. ,2003)。直 接 蛋 白 质 印 迹法 还 可 同 时 探 测 多 种 靶 物 质 。但 是 有 时 在 免 疫 反 应 中 , 标 记 一 抗 会 有 不 利 影 响 ，并 且 即 便在 最 好 的 情 况 ，标 记 过 的 一 抗 也 无 法 进 行 信 号 放 大 。因 此 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 的 灵 敏 度 通常 要 低 于 间 接 检 测 法 ，并 且 只 能 在 靶 抗 原 丰 度 较 高 时 使 用 。能 够 放 大 信 号 并 不 使 用 二 抗的 间 接 检 测 法 称 为 一 抗 生 物 素 化 。用 生 物 素 化 的 试 剂 标 记 一 抗 通 常 使 每 个 抗 体 分 子 带 有超 过 一 个 生 物 素 。每 一 个 生 物 素 都 能 够 和 酶 联 的 亲 和 素 、链 霉 亲 和 素 或 T h e r m o Scientific NeutrAvidin Protein® 发 生 反 应 。这 些 多 酶 体 系 催 化 了 合 适 的 底 物 的 转 化 ，以 此 放 大信 号 。基 本 上 ，亲 和 素 偶 联 物 替 代 了 二 抗 , 并 且 其 物 质 的 量 浓 度 和 二 抗 原 本 的 物 质 的 量 浓度 几 乎 相 同 。但 是 需 要 注 意 , 如 果 用 于 凝 胶 中 的 样 本 是 天 然 生 物 素 化 的 ，尤 其 是 在 使 用 高灵 敏 度 底 物 时 ，产 生 的 信 号 很 有 可 能 会 干 扰 靶 蛋 白 的 检 测 。
 2.2 far-Western 有 时 , 针 对 一 种 特 定 抗 原 的 抗 体 在 蛋 白 质 印 迹 分 析 时 并 不 适 用 ，或 者 无 法 获 得 。然而当 靶 蛋 白 结 合 物 可 充 当 探 针 时 ，印 迹 法 仍 然 可 行 。这 种 类 型 的 应 用 便 称 为 far-WestemBlot, 通 常 用 于 蛋 白 质 -蛋 白 质 相 互 作 用 的 发 现 或 确 认 。关 于 这 个 主 题 的 变 化 颇 多 ，并 涉及 前 文 所 述 的 所 有 方 法 策 略 。此 时 标 记 过 的 结 合 物 就 相 当 于 一 抗 , 可 通 过 与 35S 体 外 翻 译反 应 进 行 标 记 。也 可 以 将 探 针 生 物 素 化 ，并 用 亲 和 素 或 类 似 亲 和 素 的 偶 联 物 检 测 ，这样能够 更 好 地 放 大 信 号 。必 须 注 意 探 针 不 宜 过 度 标 记 ，因 为 这 会 减 弱 它 与 靶 物 质 的 反 应 能 力 。或 者 ，可 将 带 标 记 的 重 组 探 针 在 细 菌 中 表 达 (标 记 可 选 择 G S T 、H A 、c-M y c 或 F L A G ) ，通过 识 别 这 些 标 签 的 标 记 抗 体 实 现 检 测（Burgess et aL ,2000)。 2.3 半定量蛋白质印迹法 通 常 认 为 蛋 白 质 印 迹 法 是 定 性 的 ，但 当 加 入 特 定 对 照 时 ，它 也 可 成 为 一 种 定 量 方 法 。当 E L I S A 无 法 用 于 某 种 样 本 ，或 是 当 生 物 样 本 中 的 某 种 组 分 会 干 扰 E L I S A 时 , 半 定 量 蛋白 质 印 迹 法 便 表 现 出 其 优 势 。一 般 来 说 ，针 对 某 种 蛋 白 质 的 抗 体 也 能 对 与 这 种 蛋 白 质 密切 联 系 的 蛋 白 质 表 现 出 同 等 专 一 性 。在 这 种 情 况 下 ，E L I S A 会 产 生 假 阳 性 或 过 高 估 计 了
靶 蛋 白 丰 度 。 由 于 蛋 白 质 印 迹 法 需 要 用 凝 胶 电 泳 分 辨 蛋 白 质 ，分 子 质 量 间 的 差 异 可 以 用来 单 独 区 分 和 定 量 粑 蛋 白（Sato et al. ，2002;Xing and I m a g a w a , 1999)。 为 了 评 估 定 量 蛋 白 质 印 迹 法 的 有 效 性 和 准 确 性 ，我 们 要 用 纯 化 的 靶 蛋 白 作 为 内 对 照 ，绘 制 出 标 准 曲 线 。样 本 必 须 含 有 足 够 量 的 靶 蛋 白 ，使 其 量 控 制 在 标 准 曲 线 范 围 之 内 。可借 助 C C D 照 相 机 和 成 像 系 统 对 蛋 白 质 印 迹 进 行 光 密 度 分 析 ，将 条 带 强 度 转 化 为 定 量 尺度 。最 后 用 E L I S A 验 证 蛋 白 质 印 迹 法 测 出 的 曲 线 趋 势（M a t h r u b u t h a m and V a t t e m ，
2005)。 2.3.1 检 测 方 法
 SuperSignal① W est Dura 底 物（Thermo Fisher Scientific) 检测信号。用 Kodak 20000 MM成 像 站 成 像 ，并 用 成 像 站 附 带 的 印 迹 密 度 分 析 软 件 分 析 蛋 白 质 条 带 密 度 。定量蛋白质印迹数据可通过 P5 3 和 的 ELISA 实验进行验证 (Assay Designs,
Arm Arbor ,M D，根据制造商说明书完成 ELISA。 2.3.2 结 果 及 讨 论 蛋 白 质 印 迹 的 光 密 度 分 析 表 明 ，L B a 的 线 性 范 围 为 0•097〜 3.12 n g ，p 5 3 的线性范围为 1. 87〜 60 n g 。在 这 个 范 围 内 提 供 了 极 佳 的 阳 性 内 对 照 ，并 能 抵 消 蛋 白 质 印 迹 法 效 率的 差 异 。 在蛋白质印迹分析中，在 用 E G F 处 理 后 的 前 5 m in 内 IkBc 1 的水平保持恒定，但在30 min 后迅速降低 3 0 % ，最后, 在接下来的 24 h 内逐渐上升（图 33.2)。蛋白质印迹光密度分析表明，P5 3 水平在用 D ox 处理后的前 8 h 变化很小，在 这 之 后 的 20〜30 h 迅速上升 。若 用 C is 处 理 ，p 5 3 水平则在 30 h 内逐渐上升 (数据未显示）。
 LcBa ( 图 33.2 ) 和 P5 3 水 平 变 化 趋 势 可 用 E L IS A 验 证 ，并 和 已 发 表 的 数 据 一 致(K w ok et a l .，I 9 9 4 5Sun and Carpenter，1998)。在 p53 的实验 中 ，尽管通过蛋白质印迹法得出的数据已被 ELISA 所验证，但是，仔细比较这些数据可以发现，在 20〜30 h , 蛋白质印迹对 P 5 3 的数量变化更为灵敏。在 20〜30 h 存在着大量 P5 3 , 但 是 E L ISA 无法检测出这段时间中 P 5 3 正在逐渐增加，而蛋白质印迹法却可以做到。相 反 , 在 前 8 h 内，p 53
水平相对较低，E L IS A 比定量蛋白质印迹法更能较好地检测 p5 3 的变化。 虽然蛋白质印迹法和 E L IS A 同属免疫检测法，但其应用各异, 且通常所用的免疫试剂也有所不同。绝对蛋白质数量差异的产生大抵是因为用于对照组、一抗特异性的重组蛋白有所差异, 以及每种技术中蛋白质的相互作用各不相同。 三、检测方法3.1 酶联物 碱性磷酸酶 (A P，l 4 0 kDa) 作为曾经的首选酶，通常可用做沉淀显色的底物。比色反应以稳定速率进行，这使相关灵敏度和反应进程能得到精确控制。随着蛋白质研究的发展 ，H R P(40 kDa) 变得更为流行，因其稳定性好，分子质量更小。这些特性就能使每个Ig G 结合更多的 H R P 分子 ，灵敏度也就更强。此 外 ，用 于 H R P 的化学发光底物还能进一步提 f t 灵敏度。 3.2 比色检测法 比色或显色底物或许是最简便也是最划算的检测方法。当与合适的酶接触时, 这些底物便转化为不溶的有色物质沉淀在膜上，无 需 特 殊设备便可处理或观测。底 物 ，如3 ，3’，5，5’-四甲基联苯胺 (TMB)、4-氯-1-萘酚 (4-CN) 和 3,3’-二氨基联苯胺盐酸盐 (DAB)与 H R P — 同使用。 A P 的底物包括会形成不溶浓紫色沉淀的 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸-P -甲苯胺盐 (BCIP)、氯化氮蓝四唑 (NBT) 和 Fast Red(萘酚 AS-M X 磷酸盐+ F a s t Red TR盐）。从不同供应商处购得的同种底物差异可能会很大, 这是因为底物的浓度和纯度、添加物及缓冲成分都会影响实验结果。 3.3 荧光检测法 借助荧光检测的蛋白质印迹法通常用于同一印迹中有两种不同靶物质和需要高灵敏度的实验中。荧光染料 (通常称为「荧光团」,即「fluorophore」或简称「fluor」) 是一种特殊分 子 ，它在某一波长吸收一个光子能量时化学键被激发，回到基态时能发射出一个波长大于吸收光的光子。化学性稳定, 具有合适范围的高效 (强烈) 激发和发射波长的小分子荧光团可用于检测抗体的化学标签或标记，以及其他生物分子探针。 一些基于荧光剂的系统使用荧光蛋白（如藻红蛋白）或生物发光报告系统，但是这些方法十分耗时，在检测多种靶物质时具有局限性, 并且通常不具有人工合成荧光染料那样的 光 稳 定 性 和 灵 敏 度 。利 用 精 选 的 荧 光 染 料 组 所 标 记 的 特 定 探 针 ，荧 光 技 术 实 现 了 多 种靶 物 质 的 探 测 , 并 适 用 于 更 多 型 号 的 荧 光 设 备 。 尽 管 荧 光 黄 、罗 丹 明 和 氨 基 甲 基 香 豆 素 乙 酸 盐 (A M C A ) 染 料 是 传 统 的 荧 光 团 ，它们者 IS 具 有 许 多 局 限 性 。特 别 是 这 些 传 统 染 料 具 有 相 对 较 低 的 荧 光 强 度 ，容 易 发 生 光 漂 白 。新 一 代 的 荧 光 团 克 服 了 这 些 局 限 性 (表 33. 1 ) ，并 且 在 亮 度 、光 稳 定 性 和 p H 灵 敏 度 方 面都 有 巨 大 的 改 进 。这 些 新 型 荧 光 团 可 覆 盖 整 个 可 见 光 谱 及 大 部 分 的 红 外 线 光 谱 。
 当 进 行 焚 光 蛋 白 质 印 迹 实 验 时 , 通 常 选 择 弱 荧 光 (处 理 的 ) 膜 ，因 为 膜 聚 合 物 在 光 谱 可见 范 围 内 的 自 发 荧 光 会 对 检 测 造 成 干 扰 。鉴 定 靶 物 质 时 ，选 择 激 发 -发 射 光 谱 不 重 叠 的 荧光 剂 是 十 分 关 键 的 。一对 典 型 的 荧 光 剂 包 括 T h e r m o Scientific Dy L i g h t ① Fluors 549 和T h e r m o Scientific DyLight Fluors 649 或 是 D y Light Near-infrared (I R ) Fluors 680 和DyLight Near-infrared (I R ) FIuots 800。 近 红 外 线 荧 光 剂 十 分 有 用 ，因 为 蛋 白 质 样 本 和膜 聚 合 物 的 自 发 荧 光 不 太 可 能 出 现 在 这 些 光 谱 范 围 中 , 从 而 可 以 实 现 更 低 的 背 景 和 更 高的 灵 敏 度（Patonay and Antoine,1991;Sowell et al. ,2002)。 3.4 化学发光检测法 最 常 用 的 蛋 白 质 印 迹 法 底 物 是 基 于 鲁 米 诺 的 底 物 ，该 底 物 能 够 产 生 化 学 发 光 信 号 。化 学 发 光 是 一 种 能 够 产 生 光 形 式 能 量 的 化 学 反 应 (图 33. 3)。鲁 米 诺 在 H R P 和 过 氧 化 氢缓 冲 液 存 在 下 被 氧 化 ，形 成 一 种 处 于 激 发 态 的 产 物 , 从 激 发 态 衰 退 至 基 态 时 能 发 出 光 。光
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