WesternBlot的过程与优化，着重于化学发光检测2

四、化学发光信号

4.1 信号捕捉

虽然化学发光蛋白质印迹法十分常用，但是对于难于捕获的信号的捕捉却很棘手。蛋白质印迹法要用到一系列需要技巧的技术，因此许多因素都会导致无法捕捉到信号。由于变量较多 (表 33. 2)，问题印迹的问题诊断和排除就如同大海捞针一样困难。传统的方案在检测某一个蛋白质时通常都是无效的。例如 ， 一 抗可能无法识别变性状态下的固定化抗原。尽管在非变性环境下蛋白质可保持天然状态，但这却使得目标蛋白质分子质量的确定更具挑战。此外，超大型或疏水蛋白质通常会阻碍有效的膜转移。另外，小型蛋白质 (小于等于 10 kDa) 会从膜孔中穿出，无法与膜结合。因此, 为确保能够用于检测靶物质，Towbin 的原始方案一再被修改。这些修改包括使用不同的试剂进行间接检测或 4标记的一抗进行直接检测。有时可以完全跳过转移这一步骤，在凝胶内完成检测（Desaiet al.,2001)。

体 持 续 时 间 取 决 于 所 使 用 的 特 定 底 物 。产 生 了 多 少 光 、这 些 光 能 持 续 多 久 , 则 取 决 于 具 体使 用 的 底 物 以 及 系 统 中 酶 与 底 物 之 间 的 比 例 。尽 管 用 于 一 个 印 迹 的 底 物 量 相 对 恒 定 ，呈现 的 酶 的 数 量 却 和 添 加 量 以 及 其 他 因 素 有 关 (见 表 33.1)。在 蛋 白 质 印 迹 系 统 中 ，酶 联 物过 多 是 导 致 信 号 易 变 、背 景 太 深 、信 号 持 续 时 间 短 及 灵 敏 度 低 的 单 一 的 最 主 要 的 原 因 。

最 理 想 的 信 号 发 射 曲 线 是 缓 慢 衰 减 的 (图 33. 4 ) , 因 为 这 表 明 系 统 中 的 每 一 组 分 都 达到 了 最 优 化 ，并 能 产 生 可 重 复 的 结 果 。信 号 衰 减 的 太 快 会 造 成 差 异 ，使 得 灵 敏 度 低 及 信 号记 录 不 足 。持 续 时 间 长 的 信 号 能 最 大 限 度 减 小 因 转 移 效 率 、底 物 制 造 商 批 次 和 其 他 因 素造 成 的 差 异 。

虽 然 H R P 在 底 物 存 在 的 情 况 下 能 保 持 活 性 ，但 是 随 着 和 底 物 接 触 时 间 的 延 长 , H R P也 会 失 活 。在 氧 化 反 应 中 产 生 的 自 由 基 可 与 H R P 结 合 ，这 种 方 式 让 酶 无 法 再 与 底 物 反应 。系 统 中 过 量 的 H R P 也 会 产 生 大 量 的 自 由 基 ，这增 加 了 H R P 失 活 的 可 能 性 。 自由基还 会 破 坏 抗 原 、抗 体 和 膜 ，降 低 膜 再 标 记 的 有 效 性 。

4.3 蛋 白 廣 印 迹 的 优 化

每 一 个 蛋 白 质 印 迹 系 统 都 必 须 经 过 优 化 以 获 得 一 致 的 实 验 结 果 。许 多 因 素 都 会 影 响信 号 的 强 度 和 持 续 时 间 , 每 一 种 因 素 都 可 被 优 化 , 我 们 将 在 以 下 几 节 中 讨 论 。本 章 末 尾 关于 方 案 的 一 节 包 括 了 优 化 步 骤 的 具 体 指 导 和 建 议 。

4.3.1 印迹膜

膜 组 分 似 乎 不 能 影 响 H R P -鲁 米 诺 反 应 以 及 后 续 的 信 号 产 生 。然 而 ，硝 酸 纤 维 素 膜和 P V D F 膜 的 确 在 蛋 白 质 结 合 特 性 上 有 所 不 同 。一 般 来 说 ，硝 酸 纤 维 素 膜 能 更 好 地 与 蛋白 质 结 合 ，条 带 更 清 晰 ，有 时 候 灵 敏 度 也 更 高 。而 P V D F 膜 疏 水 性 更 强 , 不 易 浸湿 ，有 时会 产 生 更 多 背 景 信 号 ，然 而 ，它 具 有 较 大 的 抗 张 强 度 和 良 好 的 操 纵 特 性 。为 获 得 最 好 的 实验 结 果 ，需 要 根 据 经 验 来 确 定 蛋 白 质 印 迹 系 统 最 优 化 的 膜 类 型 、制 造 商 和 批 次 。一旦 证 明某 种 膜 在 系 统 中 有 效 ，最 好 在 整 个 研 究 过 程 中 都 使 用 这 一 批 次 的 产 品 。

4.3.2 靶蛋白

不 同 蛋 白 质 的 转 移 效 率 有 着 很 大 不 同 。在 特 定 的 设 置 的 条 件 下 ，蛋 白 质 迁 出 凝 胶 的能 力 及 结 合 膜 的 向 有 所 不 同 。转 移 效 率 依 赖 于 一 定 因 素 ，如 凝 胶 组 分 、凝 胶 与 膜 的 接 触程 度 、电 极 的 位 置 、转 移 的 持 续 时 间 、蛋 白 质 大 小 和 组 分 、电 场 强 度 及 是 否 加 人 去 污 剂 。低离 子 强 度 缓 冲 液 和 低 电 流 的 条 件 可 使 大 多 数 蛋 白 质 达 到 最 优 转 移 。使 用 与 免 疫 印 迹 相 兼容 的 或 可 逆 的 染 料 对 膜 进 行 染 色 ，可 评 估 转 移 效 率 (Sasse and Gallagher, 2008)。用 于 膜染 色 的 一 些 常 见 蛋 白 质 染 料 包 括 : 丽 春 红 S ,— 种 可 随 时 间 褪 色 的 红 色 染 料 ; 考 马 斯 染 料 ，一 种 可 紧 密 结 合 蛋 白 质 并 干 扰 免 疫 印 迹 的 敏 感 的 蓝 色 染 料 ,— 种 简 单 可 逆 的 蓝 色 染 料（Antharavally et al. ，2004)。

4.3.3 封闭缓 冲 液

很 多 不 同 的 封 闭 试 剂 都 对 蛋 白 质 印 迹 有 效 。因 为 没 有 任 何 一 种 封 闭 剂 适 用 于 所 有 系统 ，故 有 必 要 进 行 检 验 (Spinola and C a n n o n ，1985)。理 想 的 封 闭 缓 冲 液 具 有 最 大 的 信 噪比 ，而 且 不 会 与 系 统 中 的 抗 体 或 靶 物 质 反 应 。例 如 , 在 亲 和 素 -生 物 素 系 统 中 使 用 5 % 脱脂 牛 奶 作 为 封 闭 剂 可 造 成 高 背 景 ，因 为 牛 奶 中 含 有 不 同 量 的 内 源 生 物 素 , 可 与 亲 和 素 蛋 白结 合 。当 变 换 底 物 、抗 体 或 靶 物 质 时 ，仅 仅 因 为 对 于 这 一 新 系 统 封 闭 缓 冲 液 不 再 是 最 理 想的 , 就 可 能 引 起 信 号 减 弱 或 背 景 增 强 。

在 封 闭 缓 冲 液 中 加 人 表 面 活 性 剂 ，如 去 污 剂 T W e e n -20，可 为 某 些 系 统 带 来 好 处 。表 面 活 性 剂 阻 止 封 闭 试 剂 与 靶 物 质 的 非 特 异 结 合 ，或 将 膜 上 抗 体 可 以 结 合 的 疏 水 位 点 封闭 , 从 而 使 背 景 最 弱 化 。然 而 ，加 入 过 多 的 去 污 剂 会 造 成 封 闭 不 充 分 。通 常 我 们 使 用 终 浓度 为 〇. 0 5 % 的 去 污 剂 。但 是 ，为 了 得 到 最 好 结 果 , 我 们 要 确 定 去 污 剂 是 否 增 强 了 某 个 特殊 系 统 及 确 定 去 污 剂 的 理 想 浓 度 。通 常 使 用 高 质 量 低 污 染 的 去 污 剂 。

4.3.4 抗体

不 只 是 作 用 于 抗 原 的 一 抗 的 亲 和 力 很 重 要 , 一 抗 和 二 抗 浓 度 同 样 对 信 号 强 度 有 很 大影 响 。一 抗 或 /和 二 抗 浓 度 不 当 会 造 成 印 迹 上 H R P 过 多 。采 用 最 小 一 抗 浓 度 比 较 有 利 ，因 为 这 样 能 推 动 靶 物 质 的 特 殊 结 合 并 降 低 背 景 。

如 果 印 迹 不 能 产 生 足 够 的 信 号 ，就 将 所 有 的 检 测 试 剂 从 印 迹 中 移 除 (剥 离），并 使 用 不同 的 一 抗 或 不 同 的 抗 体 浓 度 重 新 标 记 ，这 种 做 法 常 常 可 以 节 约 珍 贵 的 样 品 ，并 且 节 省 时间 ; 然 而 ，不 充 分 的 剥 离 可 使 有 活 性 的 H R P 残 留 在 印 迹 上 并 产 生 信 号 。将 底 物 加 在 被 剥离 的 印 迹 上 , 随 后 便 可 检 测 出 印 迹 上 是 否 残 留 活 性 H R P 。 同 样 , 剥 离 无 法 移 除 的 大 量 失活 H R P 分 子 会 抑 制 一 抗 与 靶 物 质 的 结 合 。剥 离 并 重 新 标 记 印 迹 是 一 种 获 得 特 殊 系 统 相关 信 息 的 有 效 方 法 ，但 并 不 是 一 种 确 定 理 想 系 统 参 数 的 决 定 性 方 式 。

4.3.5 检 测 方 法

习 惯 上 ，使 用 胶 片 来 检 测 蛋 白 质 印 迹 的 化 学 发 光 信 号 。它 不 需 要 昂 贵 的 设 备 ，并 能 提供 极 佳 的 灵 敏 度 ，但 却 只 有 狭 窄 范 围 的 线 性 检 测 强 度 。通 常 需 要 调 整 胶 片 的 曝 光 时 间 以得 到 具 可 出 版 质 量 的 印 迹 结 果 ，这 会 消 耗 时 间 并 造 成 浪 费 。将 曝 光 后 的 胶 片 浸 泡 在Thermo Scientific Reagents 系 列 产 品 中 可 以 移 除 曝 光 过 度 产 生 的 额 外 信 号（图 33.5 ) 。这 些 试 剂 可 以 均 匀 地 移 除 胶 片 中 的 银 ，在 优 化 胶 片 表 观 的 同 时 维 持 信 噪 比 。

C C D 照 相 机 及 附 带 的 分 析 软 件 可 以 调 整 背 景 水 平 并 完 成 密 度 测 定 。与 胶 片 相 比 ，成像 仪 在 检 测 方 面 具 有 一 定 优 势 ，因 其 有 较 大 的 动 态 范 围 和 高 程 度 的 曝 光 控 制 ，可 在 没 有 高背 景 或 高 强 度 信 号 干 扰 数 据 的 情 况 下 尽 可 能 地 完 成 图 像 记 录 。此 外 , 理 想 的 曝 光 时 间 可防 止 条 带 信 号 饱 和 , 并 能 观 察 到 密 度 的 微 小 变 化 。相 比 较 而 言 ，胶 片 具 有 较 小 的 动 态 范围 ，条 带 信 号 也 会 迅 速 达 到 饱 和 。当 信 号 强 度 较 高 时 ，胶 片 的 低 动 态 范 围 使 其 快 速 饱 和 ，并 且 曝 光 控 制 的 局 限 性 通 常 会 产 生 过 度 曝 光 的 图 像 。

五、常见问题及其原因

5.1 没 有 信 号

初 次 曝 光 时 未 捕 获 到 化 学 发 光 信 号 , 表 明 该 蛋 白 质 印 迹 系 统 需 要 优 化 。通 常 , 信 号 缺失 由 系 统 中 酶 量 (即 HRP) 过 多 造 成 。当 信 号 不 能 被 检 测 到 时 ，采 用 更 少 量 的 酶 联 物 似 乎有 违 我 们 的 直 觉 。然 而 ，若 要 得 到 成 功 的 信 号 记 录 ，酶 和 底 物 量 的 恰 当 平 衡 是 必 要 的 。酶催 化 的 底 物 氧 化 是 不 可 逆 的 ，因 此 , 一 旦 底 物 被 氧 化 , 就 不 能 再 与 酶 反 应 而 发 光 。 因 为 酶活性持续存在，底物就成了限制性因素，并且一旦底物耗尽，信号输出就终止了。在活性酶量不足的情况下发生信号缺失是很少见的。蛋白质印迹系统中的任何因素都会造成酶量过多或不足。

为了产生能够被捕获的信号，需要调整系统参数。制备新凝胶并使用较少样品或滴定抗体能获得可重复的结果。当优化抗体浓度时，需要对印迹成像两次: 第一次在加人底物后立即进行; 第二次在孵育底物一段时间后（如 I h ) 进行。第二次检测能提供理想酶浓度的相关信息，并有助于优化参数。

并且，如果初次曝光未捕获到信号，则在底物中进行二次孵育可能会产生信号 (若一些 H R P 仍有活性）。将所有的检测试剂从印迹中剥离并再标记印迹可以在优化参数的同时节省珍贵的样品。在底物中进行一次额外的孵育并剥离印迹仅仅只能再次获取系统的一些相关信息。如果想要了解印迹与印迹之间的一致性和对比性, 就必须在每一次实验中采用相同的条件和相同的步骤。

5.2 信 号 快 速 消 失

当一个特定系统产生的化学发光信号会快速消失时，需要根据前述方法对蛋白质印迹系统做一些优化。好消息是可以获得信号，表明此次印迹已经有所优化。有些时候尽管所有的参数都是相同的，但特定系统依然会产生比通常消失得更快的信号。系统全面优化后会将这一类型的结果最小化。原方法经内部的轻微改动，就能得到虽不是最优化但却也能获得成功的系统，如转移效率以及在保存和操作过程中样品及抗体活性的改变。

5.3 背 景 过 强

产生高背景信号的原因可能是封闭不充分, 抗体与封闭蛋白质发生了交叉反应，或是使用了过量的酶联物。有时研究人员认为某种特定的底物能产生背景或增强背景。这种底物通常在酶不存在时自身无法产生信号。当使用比先前更为敏感的底物时，如果不调整参数以补偿底物灵敏度，就会产生高背景。采用最适浓度的抗体将会促进其对靶蛋白的特异结合并产生低背景。

5.4 新 的 底 物 无 法 产 生 信 号

有时 ，某个特定系统中唯一发生改变的变量为一瓶新的或批号不同的底物时，可能无法捕获到信号。通常 ，该结果是由尚未完全优化的蛋白质印迹系统造成的。蛋白质印迹的底物本身就是可变的。许多制造商仅仅控制最小灵敏度，这使得新底物可能比先前使用的批次的更加敏感。在全面优化的印迹系统中, 底物敏感度的变化和其他的变量一样，都是微小或不显著的。

5.5 膜 上 呈 现 棕 色 或 黄 色 条 带

当 H R P 被氧化和失活时会呈现棕色。一定量的酶联物中，总是会有一部分被氧化。在优化后的系统中，被 氧 化 的 H R P 的量极小并无法从印迹上观察到。黄色或棕色条带的出现表明有大量的 H R P 存 在 ，因而被氧化和失活的部分是可见的。会产生黄色带的印 迹 系 统 需 要 通 过 可 采 用 更 少 量 的 酶 联 物 进 行 优 化 。此 外 ，过 多 H R P 在 某 一 局 部 位置 时 ，则 会 在 酶 活 作 用 下 产 生 大 量 自 由 基 。 自 由 基 会 使 H R P 失 活 ，并 破 坏 抗 体 、靶 抗 原
和 膜 ，抑 制 有 效 的 再 标 记 。

5.6 条 带 或 整 个 印 迹 在 暗 室 发 光

若 底 物 孵 育 后 的 条 带 或 整 个 印 迹 发 光 ，可 认 为 系 统 中 存 在 过 多 的 H R P 。该 现 象 表 明H R P 连 接 的 二 抗 需 要 进 一 步 稀 释 ，并 且 可 能 的 话 一 抗 也 要 稀 释 。蛋 白 质 印 迹 系 统 中 涉 及的 许 多 因 素 都 可 以 引 起 酶 量 过 多 。若 整 个 印 迹 都 在 发 光 ，那 就 很 有 必 要 对 封 闭 和 清 洗 也进 行 优 化 。

5 .7 假 带 / 空心带

那 些 成 晕 轮 状 (条 带 中 间 无 信 号 ) 或 黑 色 背 景 下 整 个 条 带 都 显 白 色 的 蛋 白 质 条 带 通 常被 称 为 假 带 。 白 色 区 域 内 底 物 耗 尽 时 就 会 导 致 这 一 结 果 的 发 生 。

我 们 并 不 明 确 假 带 产 生 的 特 殊 原 因 。因 此 ，我 们 检 测 了 几 种 能 够 造 成 这 一 结 果 的 因素 。我 们 会 在 下 面 章 节 中 简 要 描 述 研 究 结 果 , 下 述 章 节 会 反 映 一 些 常 见 引 起 假 带 效 果 的原 因 ，包 括 在 凝 胶 中 加 人 了 过 多 的 靶 蛋 白 ，以 及 使 用 了 会 与 封 闭 液 组 分 发 生 交 叉 反 应 的 抗体（V a t t e m and M a t h r u b u t h a m ,2005)。

5.7.1 分析方法

间 的 底 物 孵 育 会 延 长 信 号 持 续 时 间 。使 用 W e s t P i c o 或 W e s t D u r a 底 物 能 检 测 到 低 至10 n g 的 蛋 白 质 , 甚 至 在 完 成 蛋 白 质 印 迹 的 64 h 后 依 然 可 以 检 测 到 信 号 。 W e s t D u r a 比W est P ic o 的 底 物 更 敏 感 和 持 久 。尽 管 W e s t D u r a 在 检 测 5 n g 蛋 白 质 时 能 产 生 极 强 信号, 但泳道中含量超过 100 n g 会 导 致 信 号 迅 速 消 失 ，这 强 调 了 局 灵 敏 度 检 测 系 统 下 米 用适 量 靶 蛋 白 的 重 要 性 。

通 常 用 脱 脂 牛 奶 溶 液 孵 育 印 迹 以 最 小 化 背 景 信 号 。改 变 封 闭 液 中 牛 奶 的 浓 度 不 会 产生 假 带 。 令 人 吃 惊 的 是 ，封 闭 液 中 含 0 . 5 % 脱 脂 牛 奶 可 以 增 强 低 丰 度 蛋 白 质 的 检 测(图 33. 7A ); 然 而 ，抗 体 同 封 闭 蛋 白 质 的 交 叉 反 应 确 实 会 引 起 假 带 。如 果 一 抗 或 二 抗 同牛 奶 蛋 白 质 相 结 合 ，这 些 封 闭 的 位 点 化 学 发 光 ，产 生 深 色 背 景 ，而 样 品 蛋 白 质 集 中 于 膜 表面 ，形 成 白 色 条 带 (图 33. 7B )。

高 浓 度 的 酶 联 二 抗 与 大 量 靶 蛋 白 结 合 时 会 增 强 底 物 的 催 化 作 用 ，从 而 导 致 信 号 迅 速消 失 ，使 这 些 区 域 内 的 底 物 迅 速 耗 尽 。膜 上 转 移 的 大 量 蛋 白 质 可 与 大 量 H R P 连 接 的 二抗 相 结 合 。这 些 免 疫 复 合 物 集 中 区 域 内 产 物（也 就 是 信 号）的 过 度 产 生 会 使 底 物 迅 速 耗尽 ，造 成 假 带 。总 之 ，凝 胶 过 量 上 样 、二 抗 浓 度 过 高 、底 物 孵 育 未 达 到 最 优 化 的 时 间 ，以及抗 体 与 封 闭 区 的 交 叉 反 应 均 可 引 起 假 带 。在 使 用 髙 灵 敏 度 检 测 系 统 时 ，优 化 蛋 白 质 印 迹参 数 对 于 防 止 假 带 的 产 生 是 极 其 至 关 重 要 的