1. 10 ml IDA-Sepharose 6B 装填一个柱子。柱长与柱径比例可随目的蛋白结合的紧密程度不同而变化。结合较紧的目的蛋白用短而粗的柱子就能很好地分离;
2. 3 倍柱床体积的水洗柱;
3. 3 倍柱床体积的 1mg/ml CuSO4·5H2O 洗柱;
4. 5 倍柱床体积的层析缓冲液(20 mmol/L,pH 7.5 磷酸钠盐缓冲液,0.5 mol/L NaCl)洗柱;
5. 用层析缓冲液处理蛋白质样品液,即用该缓冲液透析或 1:1 稀释。再经离心或过滤获得澄清的样品液。介质结合容量决定柱子的有效载样量,通过试验测定柱子的总结合容量是非常有用的。通常结合容量的合理估计是每 ml 介质结合 10~100 mg 蛋白质;
6. 将样品液(蛋白质浓度 1~10mg/ml)上样到金属亲和柱;
7. 5 倍柱床体积层析缓冲液洗柱,或洗至 A280 值回到甚线;
8. 5 倍柱床体积洗脱缓冲液(100 mmol/L,pH 5.0 乙酸钠,0.5 mol/L NaCl)洗脱目的蛋白;
9. 含 50 mmol/L EDTA 的层析缓冲液既可用于洗脱较强结合的蛋白质,也可用于柱子的再生。
另一个洗脱策略是金属结合竞争法,例如增加咪唑、组氨酸、甘氨酸或氯化铵的浓度,从而与目的蛋白竞争金属离子结合位点达到洗脱目的。促溶剂(脲)或去垢剂也有助于强结合蛋白质的洗脱。
浓度梯度洗脱也可试用来代替上面介绍的洗脱步骤。 展开 |