大鼠MSCs的获得和扩增实验—大鼠骨髓原代培养用于MSCs生产

大鼠骨髓

灭菌CCM含0.2μg ml两性霉素B(两性霉素B洗剂)非灭菌0.85%台盼蓝盐溶液PBSA

聚丙烯离心管 15 ml或50 ml塑料组织培养Petri培养皿 直径15 cm改良的Neubauer血细胞计数器

(a)从一根股骨所得的骨髓悬液中取出10μL，与l0μL台盼蓝混合。评估存活率，确保髙于80%。

(b)1000 g离心10 min沉淀骨髓。

(c)用25 ml预热的含抗真菌药物的CCM重悬骨髓（处理大鼠骨髓细胞使用抗真菌药物，人骨髓细胞不使用）。

(d)将25 ml细胞悬液加人到15 cm直径的组织培养板中，37℃，5% CO₂环境下至少孵育15 h。

(e)从培养箱中取出培养板，吸出培养基。

(f)用20 ml预热的PBSA润洗单层细胞。重复润洗过程3次，将最后的洗涤产物加人30 ml预热的含抗菌药物的新鲜CCM中（只有大鼠细胞使用抗真菌药物）。

(g)如有需要每隔两天重复步骤(f)维持6〜14天。

(h)每3天用倒置显微镜观察单层细胞。贴壁、成纤维细胞样的MSCs集落可以在培养板中清晰可见。某些情况下，这可能是造血细胞污染的信号，但这些细胞随着细胞传代过程可被去除。当培养物达到40%〜50%汇合时进行处理。这些MSCs标记为0代。