辅 助 方 案 1 包 裹 DNA 的金粉颗粒的制备
可以参考表 , 表中概括了本操作中制备颗粒所需的各种值。
辅 助 方 案 2 制 备 包 裹 有 DNA 的金粉颗粒的样品管
超声水浴
分 光 光 度 计（可选）
1 . 按照操作说明，将氮气罐同调节阀门和样品管制备站连在一起。同 时 将 一 段 12〜13in (30. 5〜33 cm) 或更短的一段桂管通过 l /8in Luer 接头连到 IOml 注射器上。如果没有蠕动泵，准备第二个带有接头管的注射器用于去除乙醇。
如果使用 Powderject 的样品管制备站，应使用一小段娃管（4in 或 10 cm)，将它同 IOml 注射器相连接，然后用封口膜封好。
2 . 室温轻轻颠倒 DNA/金粉/乙醇的混合液。将装有颗粒的圆锥底离心管放在超声水浴中 5〜IOs 直到不存在块状金粉。
3 . 用氮气清除空的聚四氟乙烯管道中的水气，时 间 不 少 于 15 min，有可能的话尽量长一些。将氮气压力调至 1〜2psi。通过调节管道旋转装置，将气流速度控制为 0.4〜0. 5L/min
4 . 剪一段与管子转头相等的干燥的管道（约 30in 或 76. 2 cm) ，将此 管 与 IOml 注射器相连 ，再次轻轻颠倒 DNA/金粉悬液，用 注 射 器 将 悬 液（不多于 3 ml) 快速地抽至聚四氟乙烯管道中。管道的两端留 2〜3in (5〜7. 6 cm) 的空管子，此段空管中不要有任何液体。不要取走注射器，要防止在管道中留有气泡。
5 . 确认氮气已经完全关闭，将上样管道接到管子转头上，将 DNA/金粉悬液在管道中保 留 4〜5 min。
6 . 拔去上样注射器，将 蠕 动 泵（或者是第二个注射器）连接到样品管。以 每 秒 0.5〜lin (1.27〜2. 54 cm) 的速率用蠕动泵（或者注射器）将乙醇去除。有一小部分金粉随乙醇一起被去除是很常见的。
为了在 DNA/金粉/ 乙醇混合液中以准确的速率均匀地去除乙醇，可以在样品管上 每 Iin 处做标记，用计时器定时，计算速度。此过程中不要用水，因为水会污染样品管制备站。如果使用 Powderject 的样品管制备站，上样注射器可以留在样品管上，一旦金下沉就可以去除乙醇了。
7 . 拆下蠕动泵，用管子转头以 20r/min 的转速旋转管道。转动管子 30〜45s，直到金粉颗粒均匀落在管道上。
8 . 通过调节阀，将氮气的流速控制在 0.35〜0.4L/min，使氮气在样品管中流动，让样品管充分干燥约 4 min，直 至 金 粉 从 黑 色（湿的）变 成 亮 棕 色（干的）。在管道末端看到一或两滴金粉是很正常的，而过多的金粉则说明管道中有水存在。
9 . 停止转动管道，关上氮气，把管道从转子上取下。对着灯光观察管子中金粉分布情况 ，在金粉均匀分布的样品管两末端折缝或使用记号笔的方法做记号。只用有均匀涂层或绝大多数金涂层呈细金线的管道。
如果金粉没有在管道内形成涂层，而形成一条很厚的金线，是因为乙醇去除的太慢了。如果金涂层呈漩涡或带状出现，是因为乙醇去除的太快了。如果金粉分布稀少或呈斑点状，有可能是 DNA/金粉/ 乙醇制备过程中污染了水，需要进一步干燥(步骤 10)。
10.制备过程中污染水：记 下 制 备 好 的DNA/金粉/乙醇混合液体积，离心混合液，用新 鲜 的 无 水 乙 醇 洗 涤 沉 淀 3 〜 5 次。用 等 刻 度 的 新 鲜 无 水 乙 醇 重 悬 颗 粒 。用此DNA/金粉/乙 醇（步 骤 3〜9 ) 混合液制备样品管，空管子通氮气净化的时间要更长（步 骤 3〜9)。有必要的话，可以等天气不潮湿的时候来制备管道。
11.用 刀 片 把 做 过 记 号 的 管 道 切 下 来 ，扔 掉 不 要 的 一 段 。将 剩 下 的 管 子 切 成 0.5in(1.27 cm)，最好用样品管切割仪或刀片切割管子。将管道放在有干燥剂的玻璃管中。用封口膜将盖子封口。管子可在 4°C 存 放 8〜1 2 个月。
12.可选操作：样 品 管 中 DNA 含量的定量。将 5 个 样 品 管 放 在 有 500ul 的 PH8. O 的T E 缓冲液的 1.5 ml 微量离心管中，超声，直至金粉从管壁上脱落， DNA 复溶。最大转速离心约 5 min。用分光光度计测上清 A26。值 ，计 算 D N A 的含量。理论上说包被时如果 1 0 0 % 的 DNA 都包裹在金粉颗粒上，那 么 每 个 样 品 管 可 以 得 到 l Mg 的DNA，相当于 A260的值为 0.2
辅 助 方 案 3 基因枪接种中氦气压力和颗粒大小的最优化
1 . 麻 醉 小 鼠（见 基 本 方 案 1 ，步 骤 3a) ，用电动剃须刀给腹部剃毛。用基因枪在压力100〜500psi 范围内，按 IOOpsi 的增量在不同点接种包裹 DNA 的 金 粉 颗 粒（见基本方 案 2)。每个条件下接种 2 次 ，确定在腹部皮肤上的接种位点没有重叠，点与点外圈之间的距离约为0.5 cm，每个小鼠接种四个点。
2 . 用皮肤打孔机活检接种过的点，这可在接种后数分钟内进行。按皮肤的方向将活检的皮肤放在 IinXlin 的卡片上。因为打过孔的地方很快就会愈合，不需要缝合。对进行过多次活检的小鼠可以实行安乐死（附 录 2 G)。
3 . 将卡片上的活组织放在切片盒中，用 4 % 的多聚甲醛固定组织。用石蜡包埋并切片(CPI单 元 21.4)。用伊红染色，在显微镜下观察切片中颗粒的深度。
在 所 有 的 切 片 中 ，在 角 质 层 、 表 皮 层 和 真 皮 层 都 可 以 发 现 颗 粒 。 对 各 层 中 的 颗粒进行计数，可以确定在哪种条件下，在表皮层的颗粒是占总量百分比最高的（通常 为 4 0 % 〜6 0% ) 。一般地，采用的压力变化至少在 IOOpsi 才会造成颗粒接种的深度明显不同。
