用于人诱导多能干细胞的逆转录病毒制备

实验概要

用于人诱导多能干细胞的逆转录病毒制备

主要试剂

0.25%Trypsin、1 mg/mL PDL、Lipo LTX、Opti-MEM、Polybrene、293T培养液

主要设备

35 mm培养皿、4孔培养板，0.45 µm滤器，2mL、5mL、10mL、25mL、15mL、50mL离心管、倒置显微镜、生物安全柜、超滤管

实验材料

293T细胞：293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
质粒：pMX-Sox2，pMX-Oct4，pMX-Klf4，pMX-c-Myc和pMX-GFP，逆转录病毒的gag-pol，VSV-G包装质粒。质粒扩增和提取的具体原理和步骤可见《分子克隆实验指南》。

实验步骤

（1）病毒包装
！注意：在生物安全柜中进行下述操作。
1）包装细胞293T复苏与传代
①液氮中取出装有293T细胞的冻存管，迅速放37℃水浴中直到细胞悬液完全融解。
②细胞悬液逐滴加入装有5 mL预热的293T培养液的15 mL离心管中，室温1000 r/min离心5 min，弃上清。
③用细胞基础培养液培养，一般情况下2～3天传代一次，传代比例1:5。
2）转染质粒到293T细胞
①接种前用1 mg/mL的PDL包被100 mm培养皿，30 min后弃掉PDL，用DPBS清洗后加入293T培养液准备接种293T细胞。
②倒置显微镜观察，当293T细胞90%～95%聚集时，加入0.05%Trypsin消化细胞1～2 min，用细胞基础培养液终止消化，将细胞悬液转入15 mL离心管，室温1000 r/min离心3 min，弃上清。
③按每个100 mm培养皿接种8×10⁶细胞的密度接种。一般每次转染时，接种5个100 mm培养皿，分别转染pMXs-Oct4、pMXs-Sox2、pMXs-c-Myc、pMXs-Klf4和pMXs-GFP质粒，其中GFP作为转染和感染的效率的对照。
④第二天，接种的细胞80%聚集时准备转染。
⑤弃293T细胞培养液，加入7 mL Opti-MEM培养液。
⑥准备转染：每个100 mm培养皿需要质粒24 μg（质粒的比例为vsvg:gal-pol:目的基因=3:5:8），用1 mL的Opti-MEM稀释包装质粒和目的质粒，同时加入24 μLLipo LTX kit里的Plus，混匀。室温静置5 min后加入48 μLLipo LTX。
⑦将第⑥步中的混合液室温静置30 min后，逐滴地加入到提前换好Opti-MEM培养液的293T细胞培养皿。
⑧置于培养箱过夜培养。
⑨12h后，吸弃Opti-MEM培养液，加入15 mL新鲜的细胞基础培养液。
⑩ 24 h后，吸出培养液以收集病毒，并加入15 mL新鲜的含有细胞基础培养液。48 h后再次吸出培养液以收集病毒。
！注意：所有和病毒接触过的耗材均要用84消毒液处理。
2.3 3）病毒浓缩
（1）分别把24 h和48 h收集的病毒4℃离心1000 r/min，5 min的离心，收集上清。
（2）用0.45 µm滤器过滤上清。
（3）过滤后的液体分批用超滤管（又叫病毒浓缩柱）过滤。
（4）加15 mL的病毒，4000 r/min，4℃离心20 min，收集病毒浓缩管中间管的浓缩病毒，一般可收获浓缩病毒200 μL左右，分装成小包装-80℃冻存备用。
！注意：超滤管在使用前，加5 mL DPBS后室温3000 r/min离心10 min.，润湿后使用。