拟南芥细胞培养原理及操作步骤

实验概要

了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。并通过实验练习和巩固无菌操作技术。

实验原理

植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核一质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。

在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d   时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。

主要试剂

B5培养基加上0.2mg  NAA（naphthalene acetic acid）的液体培养基（取3.2g  B5粉末培养基，蔗糖30g，200ul体积质量为1mg/ml的NAA贮备液，溶于约800ml蒸馏水中，置于磁力搅拌器上混合均匀，pH计测定pH  值，1mol/l KOH调节pH值至5.8，加蒸馏水定容至1L，铝箔纸封口后121℃灭菌20min，贮于4℃冰箱，接种前水浴或自然升至室温）。

主要设备

1. 超净工作台

2. 高压灭菌锅

3. 旋转式摇床

4. 水浴锅

5. 倒置显微镜

6. 镊子

7. 酒精灯

8. 三角瓶

9. 移液器

10. pH计

11. 恒温培养室

12. 漏斗

13. 不锈钢筛

14. 血球计数板等

实验材料

拟南芥愈伤组织

实验步骤

1. 用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入三角瓶中并轻轻夹碎。每100ml三角瓶含灭过菌的培养基 10~15ml，每瓶接种1~1.5g愈伤组织，以保证最初培养物中有足够量的细胞。

2. 将已接种的三角置于旋转式摇床上。在100r/min，25~28℃条件下，进行振荡培养。

3. 经6~10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养瓶中加新鲜培养基10ml，必要时，可用大口移液管将培养物分装成两瓶，继续培养。（若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当，应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可进行第一次继代培养。

4. 悬浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后，培养液中应主要由单细胞和小细胞团（不多于20个细胞）组成。若仍含有效大的细胞团，可用适当孔径的金属网筛过滤，再将过滤后的县浮细胞继续培养。

5. 细胞计算。取一定体积的细胞县液，加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO₃），置70℃水浴处理15min。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴县液置入血细胞计数板上计数。

6. 制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：

   1) 鲜重法（fresh weigh method）在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。

   2) 干重法（dry weigh method ）可在称量鲜重之后，将细胞进行曲烘干，再称量干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线。

上述两种方法均需每隔2天取样一次，共取7次，每个样品重复三次，整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液。

7.   细胞活力的检查。对于初学者，往往需要检测活细胞的比率。可在培养的不同阶段，吸取一滴细胞县液，放在载玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花红溶液（用培养基配制）染色，在显微镜下观察。几活细胞均不着色，而死细胞则很快被染成红色。也可用0。1%荧光双醋酸酯溶液染色，凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光，有经验的操作者，则可根据细胞形态，胞质环流判别细胞的死活。

8. 细胞再生能力的鉴定：为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力，可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上，使基再形成愈伤组织，进而在分化培养基上，诱导植株的分化。

注意事项

1. 上述步骤均灭菌操作，培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用。

2. 如培养液混浊或呈现乳白色，表明已污染。

3. 每次继代培养时，应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其它残余物的情况以有意识地留下圆细胞，弃去长细胞。