灌注固定法

实验概要

出于多种考虑，将小组织片段简单浸泡在固定液中便能得到合适的固定，而且对大多数组织来说这可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固定方法是将固定液通过管道系统如心主动脉或腹部主动脉灌输到组织中。下面介绍一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大部分器官的操作过程。

主要试剂

0.9% 生理盐水

500 ml 烧杯

4% 多聚甲醛、固定液

主要设备

麻醉剂

手术用剪刀、镊子、止血钳

小镊子

手术刀

带塞子的样品瓶 (5-10 ml)

手套、防护眼镜

蠕动泵（或将烧瓶口向上固定在距手术台上方 150 cm 处）

心主动脉灌注用输液针，长 50 mm，外径 1.3-1.5 mm

带有静脉输血用的滴注腔的灌注装置

实验步骤

1. 心脏灌注固定法

1) 设置蠕动泵，连接灌注装置和输液针。取  100 ml 水冲洗管道除去管内残留物，然后烧杯盛满 4%  多聚甲醛（冰盒预冷），将灌注管开放的末端置入烧杯。溶液体积应该与动物大小成比例，通常一只动物 100-200 ml 足够。打开阀门，调节流速  (20 ml/min)，缓慢且稳定，然后关闭阀门。

2) 找出剪刀、镊子和止血钳的手术操作部位。给动物注射合适剂量的麻醉剂。动物处于麻醉状态后，将其背部向下平放在操作台上。可以用带子固定动物。

3) 用捏反应法检测麻醉程度。在开始下述操作之前确保动物是无反应的。

4) 手术刀沿腹部膈肌纵向切一手术切口，并用剪刀剪开膈肌底部粘连的组织确保能进入胸腔。

5) 取大号剪刀，钝端向下，切穿左胸肋廓。

6) 横向切穿胸廓一到两厘米，打开胸腔。用止血钳将心脏暴露出来。准备排血和输液装置。

7) 用镊子稳定心脏（心脏应该还在跳动），在左心室跳动部位直接插入针头，垂直外露 5 mm。注意针头不要插入太多，以防刺破心室壁影响溶液循环！用止血钳将针头固定在输入口。松动阀门，使 0.9% 生理盐水保持缓慢、稳定的流速，大约 20 ml/min。

8) 用剪刀在心房处剪一口，保证溶液自由流动。如果溶液不能自由流出或从动物的鼻孔或口腔流出，则要让针头复位。

9) 当血液快排干净时，换上 4% 多聚甲醛溶液 (200-300 ml)。

10) 终止灌注，切除靶组织，放置到盛有同种固定液的小瓶中，冰上或 4 °C 固定 2 小时，再脱水包埋。4 °C 浸泡过夜固定，效果更好。

2. 腹主动脉灌注法

1) 按上述方法准备材料和动物（步骤 1-3）。

2) 沿腹部中线横向剪开一长切口，打开腹腔，将肠道轻轻推至腹腔左侧。

3) 小心地将肾主动脉起始端下方的主动脉露出。轻轻地将腹主动脉与覆盖其上的脂肪及其它粘联组织剥离开。

4) 用镊子将距远端 0.5-1.0 cm 分岔处的主动脉壁牢牢地固定住。然后将折针紧贴镊子插入主动脉腔。

5) 快速连续操作以下步骤：

            a. 用小剪刀在下腔静脉剪开一个口。

            b. 开始灌注。

            c. 夹住膈肌下方，肾主动脉起始端上方的主动脉。

6) 肾脏表面呈现颜色均一、变浅发白时表明灌注完成。灌注一只成年大鼠，流速要控制在至少  60-100ml/min，灌注 3 分钟。终止灌注，切除并清理靶组织，并将之放置到盛有同种固定液的小瓶中（见后面的固定步骤），冰上或 4 °C  固定 2 小时。4 °C 浸泡过夜固定，效果更好。

7) 脱水包埋组织。