牛艾美耳球虫子孢子抑制宿主细胞凋亡

实验概要

专一性细胞内寄生虫有复杂的逃避方式，特别是在阻止宿主细胞凋亡方面。为了研究牛艾美耳的这种能力，我们进行了体外研究，分别用牛胎儿肠胃细胞（BFGC）,牛脐静脉内皮细胞（BUVEC），非洲绿猴肾细胞（VERO）做宿主细胞。BUVEC和BFGC允许子孢子成熟为裂殖子，VERO细胞中子孢子存活几星期但没有进一步发育。高度感染的BUVEC单层细胞，感染细胞存活直到裂殖子释放，然而未感染细胞却发生凋亡。光学显微镜和TUNEL分析已处理过3-10天p.i.，表明在感染过的BFGC和VERO单层细胞中，在应用了各种凋亡诱导物后，未受染的细胞发生程序性细胞死亡，然而受感染细胞却存活。所以，感染细胞的抗凋亡效应是不依赖于药物和宿主细胞类型。我们不能证明在用秋水仙碱处理后感染细胞和未感染细胞二者的明显的区别，对于磷脂酰丝氨酸类转移到宿主细胞表面的方式,caspase-3活性和细胞色素C的释放，可能是由于获得的感染率太低。然而，我们在单细胞水平上用激光扫描共焦显微镜检查能显示，抗凋亡因子(cellular Flice inhibitory protein, c-FLIP)和(cellular inhibition of apoptosis protein 1, c-IAP1)表达增强，在感染牛艾美耳球虫细胞应用秋水仙碱后，在后来的实验中，与感染细胞直接相邻的未感染细胞也有这种现象。我们的数据表明，由于增加了c-IAP1和c-FLIP因子的表达，牛艾美耳球虫阻止了其宿主细胞发生凋亡。

实验步骤

1. 寄生虫

从德国北部分离的牛柔嫩艾美耳球虫H珠。

2. 宿主细胞和感染寄生虫

胎牛血清胃肠道细胞(BFGC)，一种永生的原代细胞系，培养于IMDM培养基，添加500U/ml的青霉素，50μg/ml的链霉素，15%FCS.细胞培养于25cm²组织培养瓶中孵育(37度5％CO₂)，直到融合。用于实验的单层细胞受胰蛋白酶作用，用含有10%FCS的IMDM培养基洗过，然后放置在组织培养瓶，12孔平板或盖玻片。

分离BUVEC并培养于内皮细胞生长液。细胞培养于25cm²组织培养瓶中孵育(37度5％CO₂)，用胰蛋白酶消化组织培养瓶中的细胞培养液，为了进一步的研究，或者放于盖玻片用激光扫描共焦显微镜(LSCM)检查。

VERO细胞培养在添加了500U/ml的青霉素，50μg/ml的链霉素，15%FCS的RPMI 1640培养基。VERO单层细胞的试验目的如BFGC和BUVEC。

含有BFGC、BUVEC和VVERO的单层细胞培养于组织培养瓶中并感染100万的新鲜牛艾美耳球虫子孢子。细胞生存依靠台盼蓝不相容试验。在不相容宿主细胞(VERO)长期生存依靠诱导寄生虫产生Ca 离子载体。

3. 凋亡诱导

放线菌素B、细胞松弛素B和秋水仙碱用于凋亡诱导剂。不同的宿主细胞对诱导剂有不同的敏感性。在后面的试验中我们用如下条件，可促发大约50%的细胞凋亡：

放线菌素D：2.5μɡ/ml孵育24h(BFGC)，3.5μɡ/ml孵育48h(VERO)；

细胞松弛素B：12.5μɡ/ml孵育48h(BFGC)，15μɡ/ml孵育48h(VERO)；

秋水仙碱：8μɡ/ml孵育48h(BFGC)，25μɡ/ml孵育48h(VERO)；

BUVEC对诱导剂感度敏感，尽管暴露在非常低浓度的浓聚物中，单层BUVEC也能在瞬间完全死亡。因此，这些试验仅限于BFGC和VERO细胞培养液。直到72h后凋亡诱导剂才能加入到感染细胞中，否则一旦感染宿主细胞寄生虫就开始放出。

4. TUNEL含量测定

单个细胞水平的凋亡分析用TUNEL含量测定法，以荧光标记DNA条带断裂。细胞培养基在8孔腔室玻片中并感染4万新分离的牛艾美耳球虫子孢子。感染3天后使用放线菌素B、细胞松弛素B和秋水仙碱。随之进行孵育，用PBS漂洗腔室玻片2次，室温(RT)时晾干，用低聚甲醛固定。在PBS中用聚乙二醇辛基苯基醚渗透化处理细胞10min。PBS漂洗2次，露置于50μl的TUNEL反应混合物，盖上盖玻片孵育(增湿，37度，避光1h)。腔室用PBS清洗3次，样品用荧光显微镜检查，用波长450～550nm的绿色荧光。

5. 钙磷脂结合蛋白(膜联蛋白)Ⅴ含量测定

凋亡早期局限于细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸类转移到细胞表面并结合到膜联蛋白V。检测试剂盒用FITC共轭的膜联蛋白V。它结合到细胞表面是为了用荧光显微镜或流式细胞仪(FCM)辨别凋亡细胞和健康细胞。简单的说，感染和未感染球虫的BFGC和VERO单层细胞都用促凋亡诱导剂。相应数量的未感染单层细胞作对照组。用胰蛋白酶消化分离出细胞，PBS清洗并与Annexin V-FITC共孵育(1:20，20min，RT，dark)。获得细胞用FCM分析或荧光显微镜分析。P.I.3，5，7，10天后，凋亡被诱导，用放线菌素D，细胞松弛素B，秋水仙碱处理24h。孵育后，细胞用胰蛋白酶消化，PBS清洗(400×g，10min，4度)。细胞用PBS悬浮，30万细胞与Annexin V-FITC共孵育(1:20，20min，RT，dark)。获得细胞用FCM分析或荧光显微镜分析。在3次试验中，每种细胞类型都用5等份。为了FCM分析，使用含有氩激光和标准滤光片的FACScalibur设备。每种样品都用Cell Quest Pro software 分析。FCS express V2软件用于数据处理。

6. caspase 3 活性的测定

诱导凋亡导致caspase 3 的激活。为了检测它作为早期凋亡的标记，受感染和未感染的BFGC和VERO细胞用促凋亡混合物处理5h。用Enz Check使细胞融菌后检查caspase 3活性。Caspase3 含量测定是检测荧光强度的改变，由于荧光染料Rhodamin-110从合成的caspase3底物中释放，随着有活性的caspase3的分裂。R-110用fluoro-luminscent reader测量。每个实验至少要重复3次。

7. 细胞色素C释放的检测

感染牛艾美耳球虫的宿主细胞的细胞色素C的释放效应的检测用ELISA。受感染和未感染的宿主单层细胞用放线菌素D，细胞松弛素B或秋水仙碱诱导凋亡，刮去，压片，存于负80度。ELISA检测。

8. 用LSCM检测宿主细胞中C-IAP1和C-FLIP的表达

BFGC培养在12孔培养皿中的玻片上，直到融合。新脱囊的子孢子用德克萨斯红标记(2.5 μM，1小时，37-38度，5% CO₂，黑暗)。标记的子孢子用PBS洗4次(600×g，15min)。每张玻片的细胞感染25万标记的子孢子。玻片上的感染细胞样品和未感染的对照组用秋水仙碱处理(48 h at 3 and 5 days p.i)。此后，细胞用PBS洗3次，用4%的低聚甲醛固定(4度过夜)，0.1%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)可渗透化处理(10min RT)。PBS漂洗细胞2次，在PBS中与1%的牛血清蛋白和5%山羊血清共育(15min RT)。样品与抗人c-IAP1和人c-FLIP的一抗反应1h(37度，增湿)，PBS洗4次，与共轭FITC羊抗兔IgG抗体孵育。PBS漂洗2次后，细胞用TOTO-3着色(1 mM，15 min，37-38度，in the dark)，以便清楚的识别宿主细胞核和细胞内寄生虫。然后用Aqua dest漂洗样品，用Mowiol medium包埋，过夜晾干，用含有氩氪/紫外激光的LSCM设备进行研究，488nm波长的绿光(FITC)，567nm的红光(德克萨斯红)，648nm的蓝光(TOTO-3)。为了定量，用Image Quant1 software测量120个受感染或未感染细胞的荧光强度。