拟南芥根毛中线粒体和微丝双标活体实时观察

实验概要

本研究用稳定表达微丝标记GFP-FABD2的拟南芥材料，结合线粒体活体标记染料Mitotracker RedCMXRos，对拟南芥根毛和线粒体作了活体动态同步观察。而且利用隐失波显微镜和spinning disc confocal显微镜比较了稳定表达标记线粒体GFP-mito和GFP-FABD2的拟南芥根毛中的线粒体移动的情况；同时还利用多种抑制剂，研究骨架动态对于线粒体移动的影响。

主要设备

倒置显微镜 (IX81，Olympus)

高孔径物镜 (Apo 1003 OHR，NA 1.65，Olympus)

实验材料

稳定表达GFP-FABD2的拟南芥材料

稳定表达Mito-GFP的拟南芥材料

将材料培养在固体培养基上，含1/2 MS盐 0.7% 琼脂，22°C，长日照 (光照16 h, 黑暗处理 8 h) 培养4天后观察。

实验步骤

1. 抑制剂处理

           所有的化学试剂来自于Sigma (St Louis，MO，USA), 除非有特别说明。1mM latrunculin B (LATB)，1mM taxol和100 μM jasplakinolide (Molecular probes，Eugene，OR，USA) 储存液用DMSO配制，-20°C下保存。2,3-butanedione 2-monoxime (BDM) 溶液现配现用，用双蒸水配制成 500 mM 母液。20 mM  oryzalin和2mM cytochalasin D (CD)母液用100% ethanol 配制，-20°C保存。抑制剂处理时, 将培养好的拟南芥小苗拔起置于载波片上，直接将用1/2 MS培养基稀释到适当浓度的抑制剂滴于材料，盖上盖玻片后置于显微镜观察。

2. 微丝和线粒体的活体同步观察
    取培养好的GFP-FABD2拟南芥置于载玻片，加入用1/2 MS培养基配置的 200 nM MitoTracker Red CMXRos 染色液，室温孵育5 min，置于spinning disc confocal microscope，60×油镜观察。GFP-FABD2 和 Mitotracker Red CMXRos分别以488 nm和 559 nm波长激发，以500-545 nm and 570-670 nm 通道采集信号。图像以Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems)和Image J 1.34e (Wayne Rasband，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA) 处理。

3. 隐失波显微观察

          隐失波荧光显微镜是在倒置显微镜 (IX81，Olympus) 的基础上构建的。多通道氩离子激光发射器发出的光 (458，488，515 nm，30 mW) 通过单模块光纤维和三组照明镜头聚焦在高孔径物镜 (Apo 1003 OHR，NA 1.65，Olympus) 的背面，从而产生隐失波，允许样品表层的荧光被激发。通过调节入射光的角度可以收集到不同样品深度的荧光。MitoTracker 的激发波长为514 nm。荧光通过100倍油镜，530-600 nm滤光片，由电耦合CCD (Micromax，MMX-512-BFT，Princeton Instruments)以200 ms/帧的速度收集time-lapse图像序列。