1. 96 孔板样本处理
1.1 操作流程
接种细胞：3×104 /孔 药物刺激 一般作用24 小时，上机
1.2 方法
在cellquest 环境下，利用control 细胞标定上样条件，并在已设好的文件
夹(INS 文件及SET 文件)下，保存好需要的上样文件 关闭cellqest 软件，
打开MPM 软件 在MPM 软件下进行一系列设定(首先在Autosample 下，
进行SettingInitial 及FinalWashing 操作，清洗整个管路 管路清洗完毕进行
上样条件设定(主要设定上样体积(一般100ul)，混合体积(一般100ul)，混合次数，
清洗次数等，在Acquisition 菜单下设定current plate(现在使用的板号是353263)，
DateStorageFolder( 即数据储存文件夹) ， AcquisitionDocument 及
InstrumentSettingsFile(上样条件从保存好的INS 及SET 文件中选定) 上样
条件设定完毕，选定96 孔板的上样范围 在Acquisition 下选择Acquire,
上样 上样完毕，退出上样板，使用次**钠及水，清洗管路(将次**钠
及水加在96 孔板上，以上样的方式清洗管路)
*须知：如果使用PBS 作为上样鞘液，上样完毕后，换用水作为鞘液，并反复冲
洗管路，防止PBS 盐结晶堵塞管路。
1.3 注释
1) 必需的control：应准备一管对于检测指标为阴性的细胞(例如：若要检测
Jurkat-NF-KB-GFP 经药物刺激样本，就需要准备一管Jurkat 细胞(GFP 为阴
性))，用于标定机器的上样条件。细胞量为1×106 个/ml，1ml。
2) 上机前，应对样本进行混合，以使样本均一(注意使用排枪吹打，勿产生气泡)。
3) 以上protocol 仅针对于悬浮细胞。
4) 药物刺激浓度需先做梯度检测。
第七章 流式细胞分析分选术
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2. Cell Cycle Assay
常用的实验细胞株包括：293(T)，MCF7，U2OS，Saos，Hela 等
以U2OS 细胞为例
2.1 细胞培养及铺板
1) 细胞株及材料：
a) 细胞株： U2OS 细胞
b) 培养基： DMEM(10%FBS，GBICO)，DMEM(无血清)
c) 培养器皿：75cm2 培养瓶,6cm 培养皿
2) 细胞培养及铺板：
a) 传代：用DMEM(10%FBS) 培养基接种U2OS 至75cm2 培养瓶，细胞长
满后铺板并传代。
注：一般一瓶细胞总数可以达到1×107 个
b) 铺板：
细胞消化：将培养好的U2OS 细胞，倾去培养基，加入2ml 1×胰酶轻轻
摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置2-3min，观察细胞从
瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁)，显微镜下观测到细胞
成单个，或是只有2-3 个细胞聚团，即可以加入5ml 含有血清
的DMEM(10%FBS)，终止胰酶的消化作用。
细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数。
细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数
铺板： 6cm培养皿按照每孔6×105 个细胞(即1.5×105/ml，4ml)
细胞加入后将6cm 培养皿沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动
(手势一定要轻柔,防止培养液泼出)，使细胞能够均匀分布，放置细
胞培养箱生长。
注：计算铺板量时，应将control 板，药物阳性对照板及质粒对照板考虑在内。
第七章 流式细胞分析分选术
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2.2 转染
1） 试剂及材料：
a) 转染试剂：Lipofectamin 2000
b) 质粒：对照质粒：pEF-BOS
p21(阳性对照)
p16(阳性对照)
GFP-spectin
目的基因质粒，构建在pEF-FN 载体上
注：若目的基因载体不是pEF-FN,则对应的空载体要相应变化。
2） 转染：细胞密度为50%-60%时，进行转染
A：0.3μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至终体积500μl/
孔。
B：9.9μL lipofectamine 2000+490.1μL serum free DMEM 体积为500μl /孔，室
温放置5min
A，B 二者混合，室温放置20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到6cm 板
细胞液中，每板为1000μL，轻轻摇晃，使DNA 分布均匀，转染5 小时后，
换置培养液(10%FBS+DMEM)。
2.3 细胞分板
细胞分板：转染12-16 小时后, 根据细胞密度按1：3 或1：2 分板，使分
板后细胞密度为30%左右,37℃继续培养30h。
2.4 加药刺激
除了利用转染质粒作为阳性对照，也可使用药物处理细胞作为阳性对照样本
细胞铺板24 小时后，加药刺激：
G1，S-arrest ：L-mimosine: 0.5mM
5-fluorourcil: 10mM
G2/M arrest : nocodazole: 50ng/ml
第七章 流式细胞分析分选术
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加药后，继续培养24 小时
附注：作为阳性对照的基因及药物的具体使用情况见附表1。
2.5 细胞收获及处理
分别收集培养液，在每个6cm 板中加入1ml 胰酶消化(细胞消化的方法同上)。
消化完毕，加入已收集的培养液(注意一一对应，防止弄错)中和胰酶。离心(300g，
5min)收集细胞，弃上清，加入2-3ml 75%乙醇(细胞量较多，可酌量多加)，votex，
充分混匀，放入-20oC 冰箱，保存。
2.6 上机样本制备
从-20oC 取出细胞样本(至少已在-20oC 放置4 小时)，离心(300g，5min)收集细
胞，弃上清。1×PBS 清洗两遍，加入100ul 1×PBS，votex 混匀，加入10ulPI(终
