DNA（基因）检测－SouthernBlot

DNA（基因）检测－Southern Blot

DNA吸印转移

1．室温下将电泳后的琼脂糖凝胶浸入500ml溶液A中，摇动30分钟后换500ml新鲜溶液A再摇30分钟，使DNA双链碱变性。

溶液A：

5M NaCl     300.0ml

10M NaOH    50.0ml

H₂O         650.0ml

2．为使凝胶重新回到中性，换入溶液B中重复上述1过程。

溶液B：

10M 乙酸铵      200.0ml

10M NaOH         4.0ml

H₂O            1796.1ml

硝酸纤维素薄膜（NC膜）

3．料盒或盘中放一玻璃板支架，倒入10×SSC，将Whatman 3MM滤纸放在玻璃板上，两头浸在液体中，用玻棒赶除气泡。

4．心地将琼脂糖凝胶翻过（扣过来）滑到纸上，放平、赶除气泡。

5．将预先浸于溶液B中的NC膜，平铺在胶上，用玻棒赶除气泡。

6．在膜上放置两层预先以10×SSC浸湿的Whatman 3MM滤纸。

7．再放6张干燥吸水纸及4堆75px厚的折叠吸水纸。

8．在纸上覆盖玻璃平板，板上可置约250g重物，下部缓冲液根据虹吸原理能被吸上来，凝胶上的单链DNA即可被吸出并转移到NC膜上。转移速度取决于DNA片段的大小。<1kb的片段在0.7％的胶中2小时即可转出，而15kb的片段需15小时以上，一般维持12～24小时。

9．转移完成后，将胶与膜取出，通过样品槽、表明记号，并剪去膜的一角，以识别方向，此时膜与胶正面观察的方向是一致的。

10．  去掉胶，令膜稍加干燥，用圆珠笔标号。

11．  如为硝酸纤维素膜，则用3MM滤膜包好，80℃烘烤2小时。若为尼龙膜则用紫外等照10分钟，使DNA牢固地结合于膜上，即可用于分子杂交。

12．  将膜在6×SSC中浸泡几分钟，放入塑料袋，按0.2ml/cm²膜面积加入预杂交液，排净气泡封闭袋口，在68℃水浴中振动预杂交2～4小时。

13．  取出塑料袋，在一角切一缺口，倒出预杂交液，按50μl/cm²膜面积加入杂交液，排净气泡、封口，再于68℃水浴中振动杂交，一般来源于真核细胞的总DNA，需杂交12～16小时。

14．  杂交结束后取出塑料袋，剪开边缘，迅速将膜转到2×SSC和0.5％EDTA溶液中室温下洗涤（振荡）5分钟，再将膜转移人2×SSC和0.1％SDS溶液中洗涤15min，然后将膜浸入0.1倍SSC和0.5％SDS溶液中68℃振荡洗涤2小时，换同样溶液再洗涤30分钟。

15．  取出滤膜在Whatman滤纸上晾干，放入塑料袋或用塑料纸包好，在暗室中将X光片与滤膜接触，封于曝光夹中，进行放射自显影1～15天。

16．  X光片被取出。常规显定影后显示杂交情况，如曝光时间不够可重新放入X光片再次曝光，直到带型显示清晰。