二、血液透析患者HCV E2/NS1区序列变异
扩增的PCR产物经双向引物直接进行序列测定得到长度为388bp的一段序列(HCV e2/NS1区序列，核苷酸位置1110-1497，氨基酸位置371-499)，发现6例患者感染的HCV株E2/NS1序列间存在差异(序列未列出)，核苷酸同源性范围为82.7％～96.1％，氨基酸同源性范围为79.8%～92.2%；此外，在1年半的追踪观察中发现同一患者感染的HCV株在不同时期的序列间存在差别，如表1。
讨论
目前临床应用抗HCVIgG检测主要用于筛选献血员及对HCV感染患者进行初筛，由于其在血清中出现的时间较晚，不能确定HCV的早期感染，因而有一定的局限性，而且，本研究病例1的检测结果证实：抗HCVIgG阴性并不排除病毒血症的存在，故而目前单靠抗HCVIgG筛选患者特别是确定健康献血员尚存在一定的不足之处。
表1 6例患者不同时期HCV E2/NS1区核苷酸与氨基酸变异
| 病例编号 | 比较日期 | 变异碱基位置 | 变异的碱基 | 变异氨基酸的位置 | 变异的氨基酸 |
| 1 | 1995年3月与1996年1月 | 1317 | C-T | 439 | - |
| 1337 | A-G | 446 | K-R | ||
| 1390 | G-A | 464 | E-K | ||
| 1411 | T-C | 471 | S-P | ||
| 1423 | A-G | 474 | T-A | ||
| 1996年1月与1996年6月 | 1284 | C-T | 428 | - | |
| 1357 | C-T | 453 | P-S | ||
| 2 | 1995年3月与1995年9月 | 1188 | T-G | 396* | I-M |
| 1195 | C-T | 399* | L-F | ||
| 1198 | A-G | 400* | T-V | ||
| 1199 | C-T | 400 | T-V | ||
| 1396 | C-T | 465 | T-M | ||
| 1995年9月与1995年10月 |
未发生变化 | ||||
| 3 | 1995年3月与1996年1月 | 1211 | C-A | 404* | T-N |
| 1334 | G-A | 445 | R-H | ||
| 1996年1月与1996年4月 | 1230 | A-T | 410* | K-N | |
| 4 | 1995年3月与1996年1月 |
未发生变化 | |||
| 1996年1月与1996年6月 | 1151 | G-A | 384* | R-N | |
| 1190 | C-T | 397* | S-F | ||
| 1195 | A-T | 399* | I-F | ||
| 1345 | C-T | 449 | P-S | ||
| 5 | 1995年3月与1996年1月 | 1172 | T-C | 391* | V-A |
| 1336 | G-A | 446 | R-K | ||
| 1996年1月与1996年6月 | 1333 | A-C | 445 | N-T | |
| 1336 | A-G | 446 | K-R | ||
| 6 | 1995年3月与1996年1月 |
未发生变化 | |||
| 1996年1月与1996年6月 | 1150 | A-G | 384* | S-G | |
| 1181 | A-G | 394* | H-R | ||
| 1183 | A-G | 395* | T-A | ||
| 1195 | C-T | 399* | L-F | ||
| 1230 | A-T | 410* | R-S |
注：*代表高变区1部位的氨基酸
同时本研究中抗HCVIgG检出阳性与HCV RNA的检出符合率很高，达61.5%(16/26)，表明抗HCVIgG阳性结果与HCV rNA的存在有一定的关联，对反映病毒血症的存在有重要的意义，也是反映疾病趋于慢性化的重要指标。此外，6例患者抗HCVIgG的两种截然不同的表现还可能反映了宿主不同的免疫状态，对研究不同HCV株感染对机体产生抗体的影响也有重要的作用。
一般认为，根据机体免疫应答抗体出现的规律，IgM型抗体先于IgG型抗体出现，因而血清抗HCVIgG检测对于感染早期诊断、区别急慢性感染有重要意义。本研究发现6例研究对象抗HCVIgM的表现类型不一(病例1、2、6抗HCVIgM持续阴性，病例3抗HCVIgM一过性阳性，病例5间隙性阳性，病例4在长达1年半的时间其抗HCVIgG持续阳性)，因此，对抗HCVIgM确切临床意义的探讨还必须综合考虑宿主免疫机能状态、感染的病毒株以及具体抗HCVIgM选择等多方面因素，尽管如此，我们仍然注意到抗HCVIgM与HCV rNA的存在呈很好的正相关，IgM阳性的同时HCV RNA的检出率高达78%(7/9)，因此，抗HCVIgM检测对说明病毒血症的存在具有重要的临床意义。
抗体检测方法操作简单、无需特殊的仪器设备，但是，正如前面我们所讨论的：单靠抗体检测还存在一定的局限性，还可能出现漏诊，因此，RT-PCR法检测HCV rNA尽管对设备、环境、人员要求很高，但却仍然必要。HCV RNA的存在是HCV在体内活动最直接的证据，有利于HCV感染的早期诊断，对于评价抗病毒疗效及估计疾病预后均有重要的意义［3］。此外，我们建议对HCV rNA检测阳性后转阴的病例不可忽视，应定期复查，并应高度重视RNA检测反复阳性的病例。
HCV E2/NS1区序列是HCV基因组中最易变异的区域，其中的高变区1(Hypervariable region 1 HVR1, 氨基酸位384410)基因在不同病毒分离株间存在很大的差别［4］，在疾病进行期该区基因变异更是频繁，HVR1基因变异被认为是宿主免疫选择作用的结果，是导致干扰素治疗效果不明显，疾病慢性化的重要原因。6例HCV感染者HCV e2/NS1区基因监测结果表明，HCV E2/NS1区序列在患者体内变异频繁，不同患者感染的HCV rNA在体内变异的部位、时间及变异率表现不一。通过与HCV RNA检测结果比较发现：HCV rNA检测结果阳转阴后经过所谓的静止期，再次检出HCV RNA时，其序列多已发生变化，提示此时病毒变异株逃避宿主的免疫清除而被选择出来成为新的优势株［5,6］，而病程则可能向慢性化方向发展。研究抗HCV抗体因素在病毒变异中的作用时，我们发现：在有无抗体生成的宿主体内均可有E2/NS1区基因的变异，但是，本研究对象病例1(抗HCVIgG、IgM始终为阴性)感染的HCV rNA在不同病程中的基因变异均发生在HVR1区以外，而其它有抗体生成病例感染的HCV rNA变异均可发生在HVR1区，提示体液免疫因素在选择高变区1变异中有重要的作用，但是它怎样发挥作用，抗HCV其它区域抗体是否也有类似的作用，对这些问题的讨论仍有待于进一步的研究。
作者单位：200438 上海，第二军医大学附属东方肝胆外科医院实验诊断科(方芳)；第二军医大学基础部微生物教研室(潘卫、戚中田、崔晓红、宋艳斌)
参考文献
1 Zonaro A, Puoti M, Friordalish G, et al. Detection of serum hepatitis C virus RNA in acute non-A, non-B hepatitis. J Infect Dis, 1991,163:923-924.
2 毕胜利，白宪鹤，丛勉尔，等.中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异.病毒学报，1993，9：114-126.
3 Ounanian A, Gueddanh N, Rolachon N, et al. Hepatitis C virus RNA in plasma and blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis C treated with alpha-interferon. J Med Virol, 1995,45:141-145.
4 方芳，潘卫，戚中田，等.我国丙型肝炎病毒囊膜蛋白E2高变区1的序列特征.中国病毒学，1998，13:34-39.
5 Kato N, Sekiya H, Ootsuyama Y, et al. Humoral immune response to hypervariable region 1 of the putative envelope glycoprotein (gp70) of hepatitis c virus. J Virol, 1993,67:3923-3930.
6 Doorn LJ, Capreles I, Maertens G, et al. Sequence evolution of the hypervariable region in the putative envelope region E2/NS1 of hepatitis C virus is correlated with specific humoral immune response. J Virol, 1995,69:773-778.
中华传染病杂志1999年第17卷第2期
