确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，“撒大网”
l 双杂交和其他双成分系统
第一阶段：诱饵-LexA融合蛋白的鉴定
诱饵-LexA融合蛋白的构建
1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。
2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48 lexAop-LEU2选择的转化酵母菌：
a. pBait + pMW12（活化测定）
b. pSH17-4 + pMW12（活化的阳性对照）
c. pRFHM1 + pMW12（活化的阴性对照）
d. pBait + pJK101（抑制/DNA结合测定）
e. pRFHM1 + pJK101（抑制的阳性对照）
f. pJK101单独（抑制的阴性对照）
3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM(Glu)-Ura-His（针对质粒组合a~e）或CM(Glu)-Ura（针对质粒组合f）。将培养板在37℃培养2~3天以选择含有质粒的转化酵母克隆。
4．制备转化子的母板。
活化和抑制活性的鉴定：X-gal和Leu2表型的分析
5．从a~f的每个转化中，用无菌的平头牙签挑选约8个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的CM(Glu)-Ura-His或CM(Glu)-Ura平板上划1 cm长的线，30℃孵育过夜。
6．第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上：
转化a~f：划线到CM(Glu, X-gal)-Ura和CM(Gal, X-gal)-Ura上
转化a~c：划线到CM(Glu)-Ura-His-Leu和CM(Gal)-Ura-His-Leu上
7．30℃将平板孵育到4天。
8．对抑制和激活性进行分析：
a. 对于抑制活性，在划线接菌12～24 h时观察X-gal表型。
b. 对于激活性，在划线接菌18～72 h时观察X-gal表型。
c. 在48～96 h之间观察Leu表型。
9．基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。
检测诱饵蛋白质表达
10． 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用。
11． 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子。
12． 转移1.5 ml培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞3～5 min。可见沉淀的体积2～5μl。小心倾去或吸除上清。
13． 加入50μl的2×SDS凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。
14． 将样品从干冰或-70℃直接转到100℃，并煮沸5 min。
15． 将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心5～30秒。加20～50μl样品到SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。
16． 电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。
17． 为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含LexA融合的诱饵的酵母裂解液。
第二阶段：筛选一个相互作用子
转化文库
1． 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop-lacZ报道子的酵母菌落，接种于20 ml CM(Glu)-Ura-His液体培养基中，30℃摇动过夜培养。
2． 稀释20 ml的过夜培养物于300 ml的CM(Glu)-Ura-His液体培养基中至OD600约为0.10～0.15。在旋转摇床上30℃摇动培养，直到OD600达到0.50左右。
3． 把培养物转移至1个250 ml的无菌离心瓶中，室温下1000～1500g（使用Sorvall GSA转子2500～3000 r/min）离心5 min。移去上清，加入30 ml无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至1个50 ml的无菌Falcon管中。
4． 1000～1500 g（同上）离心酵母细胞5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于1.5 ml含0.1 mol/L乙酸锂的TE(pH 7.5)中。
5． 在30个1.5 ml的无菌小离心管中分别加入1 μg的文库DNA和50μg刚刚变形的载体DNA。马上在每个小离心管中加入50μl的酵母悬浮液。
6． 在每管细胞悬浮液中加入300μl含40% PEG4000和0.1 mol/L乙酸锂的无菌TE(pH 7.5)，混合（不要振荡），30℃培养30～60 min。
7． 每个试管中加入40μl DMSO，翻转混匀悬浮液，在42℃的加热块上加热10 min。
8． 转化混合物铺平板：
其中的28管用于产生转化子：把每管混合物加到600px×600px的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上，将细胞涂匀，将板30℃孵育至菌落出现。
剩余2管：每管取350μl混合物加到600px×600px的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上，30℃培养平板至出现菌落；吸取每管剩余的40μl混合物用无菌的TE(pH7.5)或水做一系列的1：10稀释，每份稀释液取100μl取在100 mm CM(Glu)-Ura-His-Trp平板上，30℃培养平板至出现菌落。
初级转化子的收获和富集
9． 通过摇动法或刮擦法收获文库。
10． 如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌TE（pH7.5）或无菌水至40～45 ml，振荡或翻转试管悬浮细胞。
11． 使用台式离心机1 000~1 500g室温下离心试管5 min，弃去上清。
12． 重复步骤10和11。
13． 重新悬浮压紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。
14． 分别转移1 ml的细胞混合物于一系列无菌小离心管中，-70℃冻存。
相互作用蛋白的筛选
15． 解冻一份转化文库酵母细胞（来自步骤14），用CM(Gal-Raff)-Ura-Trp培养基按1：10稀释，30℃摇动培养酵母细胞4 h来诱导文库中GAL1启动子的转录。
16． 在适当数量的100 mmCM(Gal-Raff)-Ura-Trp-Leu dropout平板上分别培养106个细胞。
17． 30℃培养平板5天。
18． 观察平板的生长
