甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点

放射性标记DNA探针的制备

l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。

l      DNA的标记

1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。

2．向酶切反应混合液中加入

[α－³²P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基)            10μl

dCTP(2mmol/L)                                               1μl

dGTP(2mmol/L)                                               1μl

dTTP(2mmol/L)                                               1μl

DNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl）                       1μl

室温温育反应体系30分钟。

3．加入7μl 10×上样缓冲液终止反应。

l      标记探针的分离

1．将反应混合物上样于非变性凝胶。

2．10～15V/cm条件下，用0.5×TBE缓冲液电泳2～3小时。

3．将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。

4．将凝胶室温下对X光片曝光1分钟。小心操作使得显像后的X光片与凝胶能以曝光时方位复原。

5．用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记DNA片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约1mm²）后，放入微量离心管中。

6．向管中加入1ml洗脱缓冲液，37℃连续振荡，温育过夜。

7．将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管500μl），然后各加入1ml 100％乙醇，－80℃放置10分钟。室温离心15分钟沉淀DNA。

8．弃上清，用80％乙醇洗沉淀，室温离心5分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。

9．用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量TE中使标记探针的浓度为约10⁴cpm/μl。

甲基化反应

1．室温下，于微量离心管中建立如下列反应（每一DNA片段需6个离心管，3个用于起始反应，3个用于终止反应）

2．在1号和2号管中加1μl DMS，并加3μl 10％甲酸于3号管中起始反应。

3．将1号和2号管在16℃下放足4分钟，3号管在37℃温育15分钟。加入适量终止液终止反应。

4．剧烈振荡离心管并置于干冰/乙醇浴6分钟。

5．4℃离心7分钟。

6．用长巴斯德吸管弃上清，用1ml 100％乙醇清洗沉淀。

7．室温下离心3分钟。

8．弃去上清。

9．用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀，2号管的DNA沉淀用于结合反应，1号及3号管保存于－20℃备用。