叶绿体RNA的体外加工与紫外交联分析RNA
RNA的合成
l DNA模板的线性化
1.根据供应商的指导用合适的限制酶酶解含有DNA模板(如亚克隆在转录载体如pBluescript®(Stratagene)上的菠菜叶绿体psbA基因)的质粒(Schuster and Gruissem1991)。
2.用DNA琼脂凝胶(Sambrook et al. 1989)分析线性化质粒以检查酶解是否完全。
3.用乙醇沉淀DNA(Sambrook et al. 1989),并重悬DNA沉淀于水中,调整线性DNA终浓度为200μg/ml。
l DNA模板的转录
1.向微量离心管加入下列反应液
DNA模板 2μl(0.4μg)
反应缓冲液(5×) 4μl
DTT(40mmol/L) 0.5μl
NTP混合液(用于H-RNA或X-RNA) 2μl
RNA酶抑制剂 0.5μl(约15单位)
H2O 对H-RNA加8.5μl或对X-RNA加2.5μl
为避免DNA的亚精胺沉淀,须在室温或37℃加各种试剂。
注:H-RNA 用于体外加工测试;X-RNA 用于UV交联测试
NTP混合液(H-RNA用):5 mmol/L GTP,CTP,ATP 0.25mmol/L UTP
NTP混合液(X-RNA用):5 mmol/L GTP,CTP,ATP
2.向反应液中加入2μl(对H-RNA)或8μl(对X-RNA)α-[32P]UTP。
3.加0.5~1μl(即10~20单位)SP6,T3或T7聚合酶使反应终体积为20~20.5μl。
4.37℃温育40~60分钟。
5.加入15μl 5mol/L乙酸胺和100μl 100%乙醇沉淀RNA。
6.-20℃放置10分钟,4℃离心10分钟。
7.弃上清,空气和真空干燥RNA沉淀,用7μl甲酰胺染液重悬RNA。
8.在沸水中将RNA重悬液煮3分钟后,于冰上快速冷却,加样于6%的变性丙稀酰胺凝胶。
9.用Saran®膜包上凝胶,对X光片曝光约20秒。
10. 切下含有RNA的凝胶片放入1.5ml微量离心管中。
11. 在该离心管中加入:
DEPC处理过的水 180μl
DEPC处理过的乙酸钠(3mol/L, pH5.5) 20μl
DEPC处理过的EDTA(0.25mol/L) 1μl
SDS(20%) 1μl
12. 在65℃温育1~1.5小时或40℃下过夜使RNA从凝胶中扩散出来。
13. 将RNA液转移入新的微量离心管中,加入500μl 100%乙醇,-20℃放置10分钟。计数契仑科夫辐射。
14. 离心10分钟沉淀RNA,弃去上清,真空下干燥沉淀,在进入下一操作前用合适的缓冲液重悬RNA。