工程菌高密度发酵操作流程

基本原理

    发酵工业是既古老又崭新的工业，它的形成经历了漫长的岁月。随着科学技术的发展，发酵工业不断地得到发展和充实。现代发酵工业就是传统的发酵技术与现代DNA重组、细胞融合等新技术相结合，而发展起来的现代生物技术，并通过现代化学工程技术生产有用物质或直接用于工业化生产的一种大工业体系，是生物技术的重要组成部分。

    发酵工业在基因工程药物的研制方面起着不可替代的作用。重组DNA技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法大量获得的天然蛋白特别是基因工程药物能够大量生产，应用于临床的基因工程药物的市场正以每年5~15%的速度增长。采用高密度发酵技术，可以提高菌体的密度，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量）不仅可以减少培养体积、强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，提高市场竞争力。

    发酵工程菌除有高浓度、高产量、高产率外还应该满足：能利用易得的廉价原料；不致病，不产生内毒素；容易进行代谢调控；易于进行DNA重组技术。目前应用最多的是大肠杆菌（遗传背景清楚、操作简便、培养条件容易控制、成本低）。

    工程菌生长繁殖需要的条件是：良好的物理环境--发酵温度、pH值、溶氧量等；合适的化学环境--适宜工程菌生长代谢所需的各种营养物质的浓度，并限制阻碍生长代谢的有害物质的浓度。在发酵过程中许多控制参数对工程菌的生长构成影响，需不断加以调整（见下表），从而达到优化控制目的。

    发酵工艺分为批式发酵、流加式培养（Fed-batch）和程控发酵

试剂的配制

1. 种子液(1000ml, pH7.0)： 

Trypton        16g

Yeast Extract  10g

Glycerol       20ml

NaCl            5g

2. 发酵液（600ml）：      

Trypton            50g

Yeast Extract       50g

Glycerol           100ml

MgSO4·7H2O          3g

3. 补料（2400ml）：       

Trypton            200g

Yeast Extract      100g

Glycerol           1000ml

MgSO4·7H2O         12g

4. 盐（1000ml,pH7.2）：    

KH2PO4            20g

K2HPO4            40g

Na2HPO4·12H4O    70g

(NH4)2SO4         12g

NH4Cl             0.2g

仪器

Biostat 5L自动发酵罐，德国B.Braun公司。

操作步骤

1.消毒所有试剂、管路等。

2.发酵罐消毒。

3.发酵用菌种筛选  取-70℃保存的甘油菌种划平板，37℃培养过夜，挑取单菌落于5ml试管中，振荡培养至A6000.6左右，按20ml/L接种于含种子液的500ml摇瓶中，振荡培养至对数中期，作为发酵罐的种子液。

以上环节应该在实验进行前准备好。

4.打开仪器，调节相应的参数。

5.在发酵罐中加入发酵液、盐。

6.将种子液按40ml/L接种至发酵罐，控制适当范围的参数：溶氧为≥30%；温度为37℃；pH值设定为7.0，流加300ml/L的氨水以保持恒定。

7.当发酵密度到一定范围的时候（溶氧开始上升）。

8.诱导目的蛋白表达。

9.收集菌体

10.清洗发酵罐，关闭仪器。