HPLCICPMS测定水产品中五种砷形态

　　引言 
　　砷是一种广泛存在于环境、食品中的有毒并致癌的元素，其中水产品砷含量较高，也是人体摄入的主要来源。研究表明，不同形态砷具有不同理化性质导致其毒性不同，无机砷毒性最大，如亚砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsV）；有机砷毒性较小，如二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）；砷甜菜碱（AsB）通常认为无毒。因此对测定砷含量时进行砷形态分析十分必要，对水产品中无机砷的检测可直接反应出其安全性。 
　　1 实验部分 
　　1.1 实验仪器及试剂 
　　1100型四元泵液相色谱-电感耦合等离子体质谱联仪（7700x），安捷伦科技有限公司产品；离心机，贝克曼库尔特公司；pH计，梅特勒公司；恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；C18型净化小柱（OnGuardⅡRP柱）；0.22μm微孔有机滤膜。 
　　磷酸二氢铵、硝酸、正己烷、甲醇，均为优级纯；亚砷酸[As（Ⅲ）]标准品75.83μg/g、砷酸[As（Ⅴ）]标准品17.48μg/g、二甲基砷（DMA）标准品52.95μg/g、一甲基砷（MMA）标准品25.1μg/g，神甜菜碱[AsB]标准品38.8μg/g，中国计量科学研究院产品；调谐液：stock Tuning solution for ICP-MS7500 cs ，1μg/L，Agilent Technologies产品。试验用水为超纯水系统，电阻率大于18.2MΩ.cm/25℃。 
　　1.2 仪器条件 
　　（1）色谱参数。色谱柱：Hamilton PRP-X100型，250 mm×4.1 mm，10μm；保护柱：Hamilton PRP-X100型，25mm×2.3mm，10μm；流动相A：10mmol/L NH4H2PO4（用氨水调节pH值8.25），流动相B：无水乙醇，等度洗脱：A-B（99：1）；流速：1.0mL/min；进样体积：50μL。 
　　（2）电感耦合等离子体质谱仪参数。安捷伦科技有限公司7700x电感耦合等离子体质谱仪，采样模式为TRA，进样系统采用同心MircoMist雾化器，镍采样锥和截取锥。独特的氦（He）碰撞模式排除几乎所有的多原子离子干扰、全新数字控制式射频匹配的RF发生器和第三代八极杆碰撞/反应池系统（ORS3）和四极杆质量分辨器，检测质量数为m/z=75（As），m/z=35（Cl），元素的积分时间为0.5s。主要工作参数见表1。 
　　注：氩气纯度99.99%以上；氦气纯度99.99%以上。 
　　1.3 实验方法 
　　1.3.1 标准溶液的配制 
　　精密称取五种砷形态的标准品适量，先用超纯水制备成浓度为1000ng/mL（以As计）的各形态储备液，再精密吸取五种形态的储备液，用超纯水稀释制备七个浓度梯度的混合标准溶液，浓度分别为0，2.5，5，10，20，50，100ng/mL。在色谱条件下，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 
　　砷的5种形态标准溶液色谱图见图1。 
　　1.3.2 样品前处理 
　　称取打匀后的水产品试样1.0 g（精确至0.001 g），置于50 mL塑料离心管中，加入20 mL浓度为0.15 mol/L的硝酸溶液，密塞。于60 ℃恒温水浴振荡器中热浸提2.5 h，每隔 0.5 h振摇1min，取出冷却至室温。10000 r/nim离心10 min，取7ml上清液至离心管中，加7ml正己烷，振摇1min后，10000 r/nim离心10 min，弃去上层正己烷，按此过程重复一次，吸取下层清液用0.22μm有机滤膜过滤及OnGuardⅡRP柱净化后，用HPLC-ICP-MS检测。同法制备样品空白。 
　　1.3.3 仪器测定方法和计算 
　　在仪器的最佳工作参数条件下，按仪器操作规程，取七个浓度混合标准溶液，分别进样50μL，记录总离子流色谱图，以色谱图中五种砷形态色谱峰的峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，作为工作曲线。各样品溶液也分别进样50μL，通过标准曲线校正五种砷形态的浓度，并根据稀释倍数，计算样品中砷形态的含量。 
　　2 结果与讨论 
　　2.1 方法学验证 
　　2.1.1 校准曲线和检出限 
　　取混合标准溶液，用超纯水稀释为2.5ng/mL级别的标准溶液，用仪器进行分析测定，得出总离子流色谱图中各形态色谱峰的信噪比（S/N），通过计算得到相应的检出限，见表2。 
　　2.1.2 重复性、精密度和回收率 
　　重复性 精密称取打匀的鱼肉1.0g，按“1.3.2”项下的规定操作，平行测定六份，计算各形态砷质量浓度的平均值及RSD，样品含量重复性结果见表3。 
　　精密度 选择标准曲线中浓度为20ng/mL标准溶液，连续平行进样6次，计算其各次测定浓度相应峰面积的精密度，结果AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（V）RSD分别为1.8%、1.9%、1.9%、1.3%、2.5%。 
　　回收率 以鱼肉样品为本底，取9份，每3份分别加入高中低不同浓度的5种砷形态混合标准溶液，在色谱条件下进行测定，平行进样3次，计算平均回收率，结果见表4。 
　　2.1.3 水产品中五种无机砷检测结果 
　　根据优化的仪器条件和实验操作方法对本市6中水产品各20批次分别进行测定五种砷形态的含量，测定结果见表5。　　根据表6的检测结果，以6种不同水产品的无机砷含量的平均值来比较，AsB的含量为0.114mg/kg，As（V）的含量为0.001mg/kg，其余的均可视为未检出。根据GB 2762-2012食品安全国家标准食品中污染物限量中规定无机砷含量小于等于0.5mg/kg，所抽查的本市水产品均符合标准要求，而且各种砷形态的含量比较低，市民可放心食用。 
　　2.2 讨论 
　　2.2.1 分析方法的选择 
　　传统的无机砷检测方法为银盐法以及采用高浓度盐酸长时间提取后用原子荧光光度计测定， 前者方法检测的灵敏度较低，而后者提取效果较差，样品提取物对仪器污染较严重，两者已无法满足各类产品的检测要求。如今采用的检测方法为液相色谱分离和ICP-MS检测器在线联用，该仪器不但具有较高的灵敏度，分析速度快，可将砷的5种形态（亚砷酸、砷酸、一甲基砷化合物、二甲基砷化合物、砷甜菜碱）完全分离，而且基本消除了来自样品的化学干扰和背景的干扰，可用于复杂样品的检测，可以有效地解决无机砷检测方法中的一些干扰问题。 
　　2.2.2 流动相的选择与优化 
　　传统方法多采用NaH2PO4或KH2PO4作为砷形态分析流动相的缓冲盐，其中的Na和K元素在ICP-MS中很容易解离，长期运行含较高浓度Na和K元素的流动相会对仪器产生损害。本方法采用NH4H2PO4作为缓冲盐，其分离效果和NaH2PO4相当，而NH4+在仪器中不会解离，因而也不会对仪器造成损害。对流动相pH值的优化时发现，pH在7.0～9.0之间，五种砷形态都基本能达到甚线分离，但pH为8.25时分离效果和峰形最佳。 
　　2.2.3 样品的提取温度 
　　国家标准对样品的提取推荐是90℃恒温振荡器中热浸提，实验发现90℃提取时三价砷和五价砷的回收率偏低。而且温度越低，回收率越好，当温度为60℃以下时，回收率变化不明显。可能温度高会使三价砷和五价砷之间发生转换，或者会使砷挥发，具体原因还待研究。本法认为样品提取温度为60℃最佳。 
　　3 结束语 
　　实验表明，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪测定水产中砷的5种形态，具有以下3个特点：（1）无机砷的检出限为0.002mg/kg，稳定性好，完全能满足现阶段对无机砷的检测要求；（2）标准曲线线性好，精密度、准确度、灵敏度均符合要求，优化流动相的浓度及PH值，可将砷的5种形态很好地进行分离；（3）提取方法简单，采用浓度0.15 mol/L HNO3浸泡提取后即可进行测定。 
　　参考文献