免疫球蛋白提取技术(Immunoglobulinisolationtechnique)2

九、蛋白定量技术 
  
（一）双缩脲测定法 
1．原理  蛋白质中的肽键有双缩脲反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强，游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出毫克水平。 
2．试剂配制 
硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）               1.50g 
酒石酸钾钠                           5.00g 
H₂O                                500.0ml    
10％氢氧化钠（不含硫酸钠）          300ml 
H₂O           加至                 1 000ml 
此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。 
3．标准曲线的制备 
⑴ 准确称取牛血清白蛋白1.0g（必要时须首先采用凯氏定氮法测定牛血清白蛋白制品中实际纯蛋白含量，然后换算），以生理盐水配成1％的浓度。 
⑵ 将1％的牛血清白蛋白按表8-1进行稀释： 
表8-1 牛血清白蛋白稀释方法表

注：1％牛血清白蛋白，经凯氏定氮测定含纯蛋白为80％。
⑶ 混匀后于室温放置0.5h～1h，光电比色（540nm），顺序由低浓度至高浓度，每管测3次，求其平均值。
⑷ 以OD值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。
4．样品测定
⑴ 取样品0.1ml，加生理盐水1.4ml。也可将样品做1﹕10稀释加1ml，再加生理盐水0.5ml。
⑵ 加双缩脲试剂4.0ml，混匀，至室温0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。
⑷ 测OD540值。
⑸ 根据OD值从标准曲线上查出蛋白含量。
注意：各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异，一旦标准曲线制定后，样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致，否则结果有差异。
（二）紫外光谱吸收法
1．原理  本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试剂，测完后，样品可回收。
    2．标准曲线的制备
    ⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理盐水中。
    ⑵ 以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以盐水对照。
    ⑶ 测各管OD280值。
    ⑷ 以OD280值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
    3．样品测定
将待测样品以盐水适当稀释，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间，以生理盐水为对照，测OD280值，从标准曲线上查出蛋白含量。
（三）Folin酚法
    1．原理  蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸作用后，在碱性条件下不稳定，被还原成蓝色的化合物（钼蓝）。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高，且不受溶液中脂多糖的干扰。
    2．试剂
    试剂甲：
A液：Na₂CO₃                 10.00g
      NaOH                   2.00g
      酒石酸钾钠（或钾盐钠盐）0.25g
     混合、溶于500ml蒸馏水中。
B液：CuSO₄·5H₂O               0.5g
       H₂O                 100.00ml
        用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。
试剂乙：
   于磨口回流瓶加入下列试剂
   Na₂WO₄·2H₂O                100.00g
   NaMoO₄·2H₂O                 25.00g
   H₂O                          700.00ml
   85％H₃PO₄                      50.00ml
   浓HCl                         100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：
   硫酸锂                       150.00g
   H₂O                          50.00ml
   溴水                          数滴
开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色微带绿色（如仍呈绿色，须重复滴加液体溴步骤）。稀释至1L，过滤，滤液置于棕色瓶保存。使用时用标准NaOH液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（加水约1倍）使最终浓度为1mol/L。
3．标准曲线的制备
⑴ 取标准牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸馏水中，使成250μg/ml。
⑵ 按表8-2稀释。
表8-2 标准曲线稀释方法