细胞免疫化学：免疫酶标技术

1） 直接法

1．标本固定。
2．PBS洗涤2×3分钟。
3．1％ H₂O₂（或1％ H₂O₂ 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。
4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。
5．滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。
6．PBS洗涤3×3分钟。
7．DAB＋H₂O₂显色5～10分钟，镜下控制染色结果。DAB＋H₂O₂应用前15分钟配制。
8．充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

2） 间接法

1．标本固定。
2．PBS洗涤2×3分钟。
3．1％H₂O₂（或1％H₂O₂ 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。
4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。
5．滴加第一抗体，37℃1小时或4℃过夜。
6．PBS洗涤3×3分钟。
7．滴加酶标二抗，室温1小时。
8．PBS洗涤3×3分钟。
9．0.04％DAB＋0.03 ％H₂O₂显色5～10分钟。
10． 充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

3） PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法）

1．标定固定后，PBS洗涤。
2．1％H₂O₂（或1％H₂O₂ 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10～20分钟。
3．PBS洗涤2×3分钟。
4．正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20分钟。
5．滴加一抗，室温1小时或4℃过夜。
6．PBS洗涤3×3分钟。
7．滴加二抗，室温30分钟。
8．PBS洗涤3×3分钟。
9．加PAP复合物，室温60分钟。
10． PBS洗涤3×3分钟。
11． 0.04％DAB＋0.03％ H₂O₂显色5～10分钟。
12． 充分水洗。
13． 苏木精复染，封片观察。

4） 双PAP法

1～10同单PAP法。
11． 二次加酶标二抗。
12． PBS洗。
13． 二次加PAP。
14． PBS洗。
15． 0.04％DAB＋0.03 ％H₂O₂显色5～10分钟。
16． 苏木精复染核，封片，镜检。

5） ABC法（卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法）

1～8同PAP法
9）加ABC液，室温60分钟。
10） PBS洗。
11） 0.04％DAB＋0.03％ H₂O₂显色5～10分钟。
12） 充分水洗。
13） 苏木精复染核，封片，镜检。