本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：
在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。
实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：
第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。
第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。
对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。
接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
大家马上就会想到几个问题了：
第一：引物怎么设计呢？
第二：模板怎么去掉呢？
第三：怎么拿到质粒呢？
对于第一个问题：怎么设计引物？
我只能讲一些原则，并举一些例子。
引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：
不过这种突变引物要加上一个原则：
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。
这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：
X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
*********************************************** ************
|------>deletion
X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020
现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
************************************************************
（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）
我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。
故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。
引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。
这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物
