免疫复合物的检测

发布时间：2019-08-13 09:21 原文链接：免疫复合物的检测

免疫复合物在体内存在有两种方式，一是存在于血液中的循环免疫复合物（CIC），一是组织中固定的免疫复合物。免疫复合物的检测技术可分为抗原特异性方法和非抗原特异性方法。在大多数情况下，免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂，所以抗原特异性方法并不常用。

一、循环免疫复合物的检测

根据免疫复合物的物理学、免疫学和生物学特性，已经设计出很多检测CIC的方法（表1）。

表1 循环免疫复合物的常用检测方法

类别	原理	方法	敏感性	备注
物理法	分子大小	1、超速离心	——	适于研究
2、分子超滤	——	适于研究
3、凝胶过滤	30μg	适于研究
溶解度	1、PEG沉淀	20μg	粗定量，易推广
2、冷沉淀	——	定性，临床应用
补体法	固定补体，结合C1q	抗补体试验	0.1μg	常用，特异性差
1、C1q凝胶沉淀试验	100μg	定性，不易普及
2、C1q偏离试验	4μg	不易普及
3、液相法	10μg	不易普及
4、固相法	1μg	不易普及
胶固素	胶固素结合试验	3μg	敏感，稳定
抗Ig法	结合RF	1、RF凝胶沉淀试验	100G	定性，不敏感
2、mRF固相抑制试验	1～20μg	不易普及
3、PRF凝集抑制试验	1～10μg	不易普及
结合Ig	抗抗体法	2～3μg	不易普及
细胞法	Fc受体	1、血小板凝集试验	1～4μg	需新鲜制备
2、ADCC抑制试验	5～10μg	细胞活性质控难
3、Mφ吞噬抑制试验	0.03μg	细胞活性质控难
补体受体	1、Raji细胞法	6μg	需维持细胞株
2、花环抑制试验	10μg	影响因素多

（一）物理测定法

1、聚乙二醇法聚乙二醇（PEG）是乙二醇聚合而成的无电荷形多糖分子，分子量变化范围较大，常用的分子量是6000。用3％～4％浓度的PEG可以选择性地将大分子免疫复合物沉淀下来，其作用机制尚不甚清楚。将PEG溶液与待检血清混合，置4℃冰箱过夜后离心，将沉淀物用PEG溶液充分洗涤，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波长280nm下测量溶液的吸光度；也可利用散射比浊法直接测定PEG沉淀的免疫复合物；以不同浓度的热聚合IgG作为参考标准来计算CIC的含量。聚乙二醇法简单易行，可在临床工作中推广。但此法易受多种大分子蛋白和温度的干扰，特异性稍差。PEG法还特别适用于沉淀获得CIC，再进行解离分析其中的抗原与抗体。

2、冷球蛋白测定在某些病理情况下，血清中的免疫复合物具有可逆性冷沉淀的特性，于4℃冰箱中放置1～3天可自发地沉淀下来；此种情况多见于冷球蛋白血症，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、肿瘤相关抗原、肾小管上皮、甲状腺球蛋白、红细胞基质等，还有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒、牛白蛋白和马蛋白等。

（二）补体相关测定法

IgG和IgM类抗体与抗原结合后，重链CH2区的补体结合点暴露，可以固定C1q并激活补体的系列反应，这是利用补体有关技术检测免疫复合物的基础。

1、C1q结合试验将待检血清先行加热56℃30min，以灭活其中的补体和破坏已与CIC结合的C1q，空出补体结合点。CIC与C1q的结合可用多种方法进行检测，常用的有以下3种。

（1）液相法先将同位素标记的C1q与灭活过的血清标本混合作用，再加入0.5%（终浓度）的PEG将结合了C1q的CIC沉淀下来，通过检测沉淀物中的放射活性来计算CIC的含量。

（2）固相法先将C1q吸附于固相载体表面，加入待检血清使CIC与C1q结合，再加入同位标记的或酶标记的抗人IgG或SPA，最后检测其放射活性或酶活性。

（3）C1q偏离试验先将同位素标记的C1q与灭活的血清标本混合，再加抗体致敏的绵羊红细胞，温育后离心，检测红细胞上的放射活性。红细胞的放射活性与免疫复合物的量呈负相关。

2、补体试验本法的原理类似补体结合试验。将一定量的补体（多为混合豚鼠血清）与灭活的待检血清混合温育，反应后加入致敏绵羊红细胞。如出现溶血表示血清中没有CIC存在；不溶血说明标本中有CIC存在。将血清标本做不同稀释，并与已知的热聚合IgG作对照，可以计算出CIC的含量。本方法的灵敏度较高，且易于在一般实验室开展，不足之处是特异性较差。

3、胶固素结合试验胶固素（conglutinin）是牛血清中的一种正常蛋白，能与C3d特异性结合；体内与补体结合的CIC都带有C3d，因此胶固素可与CIC结合。用一定量的胶固素包被塑料管，往管中加入稀释的血清标本，温育后再加入同位素标记或酶标记的抗人IgG抗体，最后检测各管的放射活性或酶活性，计算CIC的含量。胶固素性质稳定、容易保存、来源方便、价格便宜，检测方法也不复杂，便于推广。本法的不足是只能检出已结合补体的CIC，但不论何种激活途径都一样检出，并可用作CIC分离。

（三）抗球蛋白测定法

类风湿因子（RF）为抗IgG的自身抗体，与变性IgG、热聚合IgG和IC都有较强的亲和力。单克隆RF（mRF）可从待发性冷球蛋白血症的血清中提取，多克隆RF（pRF）可从类风湿性关节炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。

1、mRF固相抑制试验将mRF吸附于固相载体上，随后加入血清标本，再加入同位素标记的可溶性热聚合IgG。如果标本中含有IC，固相mRF已与IC结合，热聚合IgG与mRF的结合使被抑制，所以固相中的放射活性与CIC的含量呈负相关。也可用同位素标记的mRF先与血清标本反应，再加入热聚合IgG附着的琼脂糖珠，温育并离心洗涤后测量沉淀物的放射强度，测定值与CIC的含量呈负相关。此法的敏感性比前法更高一些。

2、pRF胶乳凝集抑制试验将pRF与血清标本混合，再加入IgG致敏的胶乳悬液。如果标本中有CIC存在，则pRF先与之结合，凝集反应呈阴性。

3、抗抗体法抗抗体可存在于极个别的健康人血清中，是一种抗IgG F（ab＇）2的IgM类抗体，能与已结合抗原的IgG反应，但不与游离的IgG或热聚合IgG反应，因而特异性较高。先将抗抗体与待检血清混合，再加入IgG致敏的人O型Rh+红细胞；如标本中有CIC存在，抗抗体被中和，致敏红细胞不出现凝集。

以上各种抗球蛋白试验以mRF法敏感性最高，但是mRF较难寻找。这类方法易受内源性RF的干扰，最好先行检查并除去标本中的内源性RF后再行试验。若遇标本中有聚合Ig，RF法也易出现假阴性；改用抗抗体法可避免这种现象，但是抗抗体的来源困难。