CRISPR／Ca9应用及前沿研究

CRISPR：细菌体内一串规律成簇的间隔短回文重复 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)DNA 序列，是大多数细菌及古细菌中一种获得性免疫系统。现在使用的 CRISPR/Cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来，该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。

原理

此系统的工作原理是 crRNA(CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA(trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的 sgRNA (single-guide RNA)，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。

作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子 (unifying factor)，能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。

将蛋白与无核酸酶的 Cas9(Cas9 nuclease-null) 融合，并表达适当的 sgRNA，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标 DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA。这一套系统为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

有什么用？

通过 Cas9 蛋白形成 DNA 双链的断裂，然后细胞通过 NHEJ 的修复会造成 INDEL 效应 (insertion and deletion)，进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。此外，还可以通过同源重组等方式达到对基因精确编辑的目的。

事实上，在此之前已经发展了多种基因编辑工具，如：ZFN，TALEN 等，但实际应用不方便或成本过高。CRISPR/Cas9 系统则相对较为简单，廉价，高效，而且可以多处打靶。

此外，在内切酶活性失活的 Cas9 蛋白后加入 KRAB/VP64 等 effector 形成融合蛋白，可对下游基因进行调控。

怎么用？

如果是对于细胞的编辑可通过导入编码 guide RNA 和 Cas 9 的质粒；若是做动物模型一般则是显微注射 RNA。Addgene 上有多个实验室开发出来的载体，具体可查看：Addgene: CRISPR/Cas Plasmids for Genome Editing

意义

CRISPR/Cas9 系统可谓是 2013 年生物界的焦点，这项技术相对于 ZFN,TALEN 等基因打靶技术可以说是简便，经济得多，一般的实验室都可以构建自己的平台。如果要应用于临床治疗中，其脱靶效应应该是最应该解决的问题。该技术应用于临床治疗应该还有一段距离。

以下是 CRISPR/Cas9 重大的研究或发现。

1. 两篇 Cell 表明利用一种基于 CRISPR/Cas9 的技术有望治疗脆性 X 染色体综合征

doi:10.1016/j.cell.2018.01.012; doi:10.1016/j.cell.2016.08.056

来自美国怀特黑德生物医学研究所的研究人员首次使用他们开发的一种移除甲基化的改进型 CRISPR / Cas9 系统恢复了受这种疾病影响的神经元中的 FMR1 基因活性，这提示着这种方法可能经证实是一种靶向由异常甲基化引起的疾病的有用范例。

这项研究是首个直接的证据表明对 FMR1 基因的特定片段进行去甲基化能够重新激活这个基因，从而拯救受脆性 X 染色体综合征影响的神经元（以下称脆性 X 染色体综合征神经元）。

2.Science：利用 CRISPR/Cas9 构建出细胞事件记录器---CAMERA

doi:10.1126/science.aap8992; doi:10.1126/science.359.6377.728

在第一种被称为「CAMERA 1」的细胞记录系统中，来自美国布罗德研究所的 Weixin Tang 和 David R. Liu 两名研究人员将两种彼此之间略有不同的质粒注射到细菌细胞中，随后在接触到所需的刺激物期间，利用 CRISPR/Cas9 对这两种质粒中的一种进行切割，从而诱导细胞产生另一种质粒来取代它。

这样做就会在事件发生时记录它们。这种技术允许这两名研究人员记录细胞如何对营养物或抗生素等刺激物作出反应。

在第二种被称为「CAMERA 2」的细胞记录系统中，当所需的信号在细胞中发生时，这两名研究人员利用碱基编辑器（base editor）改变遗传密码中的单个碱基。利用这种技术，他们记录当接触病毒、营养物和抗生素等刺激物时，细胞如何作出反应。他们报道这种技术成功地用于细菌细胞和人细胞中。

3.Cell Rep：解释为何 CRISPR/Cas9 存在脱靶效应

doi:10.1016/j.celrep.2018.01.045

Cas9 蛋白的发现简化了基因编辑，甚至可能在不远的将来消除很多遗传性疾病。利用 Cas9，科学家们能够切割细胞中的 DNA，从而校正发生突变的基因，或者将新的遗传物质导入到这个新被切开的位点上。

最初，CRISPR/Cas9 系统似乎是非常准确的。然而，如今，显而易见的是，Cas9 有时也切割与它靶向的序列相类似的其他 DNA 序列。在一项新的研究中，来自荷兰代尔夫特理工大学的研究人员开发出一种数学模型来解释为何 Cas9 会切割一些 DNA 序列，同时又让其他的 DNA 序列保持完整。

4.Nat Microbio：重大发现！科学家发现新的 CRISPR/Cas9 系统！

doi:10.1038/s41564-017-0103-5

来自弗莱堡大学的科学家们现在发现 RNA 酶 E 也可以作为蓝藻细菌中 CRISPR/Cas9 系统的 RNA 剪刀。这种酶非常常见，不仅出现在光合成蓝藻细菌中，同时还出现在一些致病的细菌和植物叶绿体中。它是所有这些物种正确调节基因表达的重要因子。