为啥你的细胞这么矫情？不愿贴壁呢？

我们可能都有过这样的经历：

• 辛苦呵护的细胞，怎么也不愿意贴壁；

• 贴壁了又很容易成块或者成团掉下来；

• 原本贴壁的细胞，复苏后细胞不贴壁了；

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遇到这样的问题你都如何解决？这次我们就来聊聊，为啥你的细胞为这么矫情，不愿贴壁呢？

体外培养细胞贴壁与什么有关？

首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。

贴壁的过程可能是这样的：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面）。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。

所以细胞贴壁与否和细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。

细胞为什么要贴壁？

细胞贴壁的过程使形态发生很大变化，细胞形态改变是细胞内骨架（是真核细胞中的蛋白纤维网架体系，由微管、微丝及中间纤维组成的体系）本身和细胞外基质共同作用的结果。

密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）会沉降在底面上，那么细胞要生存必定得改善这个环境，分泌细胞外基质，改善底面的结构，然后很自然就贴附在底面上了。

密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上，所以不可能贴在底面上，但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。

细胞不贴壁，可能是这些原因？

• 细胞的传代最重要的是胰酶处理时间：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。

• 缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。

• 支原体或细菌的污染。

• 培养液配置、储存不当，如 pH 值过碱，Gln 量太少等原因。

• 复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。

• 接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质。

• 复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。

如何促进贴壁效果？

1. 适度消化细胞：HepG- 2、A549、Hela、SGC- 7901 几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理 5 - 6 min，C2C12、COS- 7、NIH- 3T3 比较容易脱落，2 min 足矣，P19Cl6 和 293 细胞贴壁不紧，可在 PBS 漂洗后，直接换新鲜培养基打散。

2. 最好用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶, 那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂 Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。

3. 正确配制消化液或培养液。

4. 使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。

5. 复苏新的细胞，第一周用 20% 血清帮助细胞复原。

6. 传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。

7. 细胞传代 24 小时之内，最好不要晃动，以免影响贴壁。

8. 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的 3T3 细胞为饲养层，另外降低 pH、Ca^{2 +}含量和温度，均有利于上皮细胞生长。