变性梯度凝胶电泳

1. 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50-60 ℃，变性剂0-100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

2. 为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30-40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。

3.  作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100-500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

DNA样品

尿素 去离子甲酰胺 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 琼脂糖 

PCR扩增仪 变性梯度凝胶电泳仪 凝胶成像及分析系统 紫外透射仪 高速离心机 电泳仪 电泳槽 微量加样器 Tip头 Tip头盒 Eppendorf管 Eppendorf管架

1.PCR反应

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。

3.垂直变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0-100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。

PCR产物加上样缓冲液后上样，300-400μl/孔，电压150V，温度60℃，时间2-4小时。

4.平行变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。

PCR产物加上样缓冲液后，25μl-30μl/孔，电压150V，温度60℃，时间3-6小时。

5.染色5分钟，凝胶成像仪分析结果。

1.  在混合和灌胶时应避免产生气泡。

2.  有溶液应保存于4℃棕色瓶中，一般几个月到一年内有效。

3. 电泳时凝胶温度必须保持恒定，要达到这一要求，可把胶板浸没于充分搅拌的温控缓冲液槽内。对于缺乏变性剂时比较容易变性的DNA 来说，槽内的温度选择在60℃稍微超过熔点，并且大部分的工作都在60℃下进行（但温度稍高或低一点都可采用）。温度保持恒定可将电泳缓冲液加热到60℃，并把胶浸入其中进行电泳即可。

4.该实验中提取DNA，以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己。

一、实验过程中的操作细节：

1. 点样的时候最好用微量进样器，避免污染和样品漂浮。

2. 为避免边缘效应，两边可以一定点一些样品。

3. 制胶是关键。玻璃板一定要洗干净，在灌胶时，要匀速的转动滑轮，将凝胶液匀速的灌入玻璃板中，液面要保持水平。