cDNA文库构建

cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。

 

mRNA

DTT 蒸馏水 dNTP EDTA SDS 乙醇 聚合酶 琼脂糖 DNA聚合酶 BSA T4 DNA连接酶 酚 氯仿 异戊醇 PCR纯化试剂盒

制冰机 离心机 水浴锅 电泳仪 离心管 移液枪 培养箱

一、Superscipt II—RT合成第一链

1.  在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water

（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。）。

2.  混匀后，70℃反应10分钟。

3.  反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。

4.  稍微离心一下，顺序加入以下试剂：

（1）4 ul 5×first strand buffer

（2）2 ul 0.1 M DTT

（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)

5.  混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。

6.  反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。

7.  42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

二、cDNA第二链的合成

1.  第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega)：

（1）20 ul 10×DNA Polymerase I buffer

（2）6 ul 10 mM dNTP(自己配制)

（3）xul dd H2O

（4）1 ul RNase H(2 U/ul)

（5）10 ul DNA Polymerase I(10 U/ul)

总体系为200 ul。

2.  混匀后，16℃反应2.5小时。

3.  70℃灭活10分钟。

4.  反应完成后，得到200 ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上。

5.  取2 ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。

注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。

三、 双链cDNA末端补平

1.  在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega)：

（1）6 ul 10 mM dNTP

（2）2 ul T4 DNA Polymerase(8.7 U/ul)

（3）2 ul BSA(10 mg/ml)

2.  稍微离心混匀反应物，37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟。

3.  加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后，常温下13 000 g离心5分钟。

4.  离心后，吸取上清于另一1.5 ml eppendof管中，加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后，常温下13 000 g离心5分钟。

5.  吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V 3M NaAc(PH5.2)和2.5 V预冷的无水乙醇,混匀，-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA。

6.  第二日，将昨日沉淀物在4℃，13 000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA。

7.  离心完毕，弃上清,加入1 ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13 000 g离心5分钟。

8.  离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味。

注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

四、PCR纯化试剂盒操作流程

1.  溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。

2.  向200 ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

3.  加入spin column中，13 000 rpm离心1 min。

4.  加入0.75 ml buffer PE，13 000 rpm离心1 min。

5.  13 000 rpm，再离心1 min。

6.  将spin column放入一新的离心管中，加入50 ul buffer EB，静置10 min。

7.  13 000 rpm离心2 min。

8.  加入30 ul buffer EB，静置10 min。

9.  13 000 rpm离心2 min。

10.  加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

五、 EcoR I adaptor 加接

1.  往双链cDNA沉淀中加入9 ul EcoR I adaptor(400 ng/ul)，4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀。

2.  溶解完成后,顺序加入下列试剂：

（1）1.2 ul 10×Ligase Buffer

（2）1 ul 10 mM rATP

（3）1 ul T4 DNA Ligase(4 U/ul)

3.   混匀后，4℃连接3days或者8℃过夜连接。

六、 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1.  连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase。

2.  稍微离心使反应物集中至管底，室温下放置5分钟,然后加入下列试剂：

（1）1 ul 10×Ligase Buffer

（2）1 ul 10 mM rATP

（3）6 ul dd H2O

（4）1 ul T4 PNK(10 U/ul)

3.  37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟。

4.  稍微离心使反应物集中至管底。

5.  室温放置5分钟;然后加入下列试剂：

（1）4 ul Xho 10×Buffer

（2）2 ul BSA

（3）5ul ddH2O

（4）8ul Xho I (10 U/ul)

6.  37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟。

7.  反应完成，双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

七、胶回收cDNA

1.  配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2 ul EB/300 ml 胶。

2.  取4℃保存样品上样，40 ul/孔。

3.  电泳50 V，1 h。

4.  紫外灯下分别切下500~1 kb、1.0-2.0 kb及2.0-4.0 kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5 ml离心管中。

5.  称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100 mg胶中加入300 ul buffer QXI）。

6.  50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5 ul QIAEXII。

7.  50℃ 水浴10 min，每隔2 min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮。

8.  4℃，13 000 rpm，30 s （弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）。

9.  加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬。

10.  离心并去上清（同操作8）。

11.  加入500 ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30 s，去上清。

12.  再加入500 ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30 s，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清。

13.  超净台上吹干（至无乙醇味），加入10 ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5 min，13 000 rpm，30 s。吸上清，冰上放置。

14.  取1 ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1 kb ladder）及DNA含量标准（10 ng，20 ng）作对照。

15.  将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。

1.  RNA 的提取（例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定）。

2.  要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。

3.  由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。

4.   文库构建要选择合适的载体，常规用的是 λ-噬菌体，这是因为 λ-噬菌体 DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。  

5.  胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

6.  胶回收时电压要稳定。

 

一、cDNA构建成功关键因素

1.  保证获得数量足够的高质量的起始RNA

构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。

老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。

至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。

2.  反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键

这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。

反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。

少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

3.  层析柱cDNA分级很关键

这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。

获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。

噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。

一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。

一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。