| 实验步骤 |
阶段 1: 反转录酶催化合成 cDNA 第一链
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
放线菌素 D:
只在使用带有 RNaseH 活性的野生型 Mo-MLV 反转录酶时才需要用放线菌素 D。见第 7 章信息栏“放线菌素 D”。
二硫苏糖醇（DTT 1mol/L)
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
KCl(1mol/L)
MgCl2(1mol/L)
Tris-Cl(1mol/L, 室溫 pH8.3)
酶和缓冲液
反转录酶
有数家厂商供应重组的鼠源反转录酶。我们强烈推荐没有
RNase H 活性的突变体酶（如 Life Technologies 公司产的
SuperscriptⅡ反转录酶)。正如在信息栏“Mo-MLV 反转录酶”中所讨论的，反转录酶制剂的比活决定于在大肠杆菌表达此酶所用的特定
cDNA 克隆, 有关酶的情况可査阅每一个厂商的说明书（如每微克 poly（A）+RNA 加入的酶单位数，反应温度）。更多的资科参见本方案结尾处的疑难解答“cDNA 第一链合成的优化”。
Mo-MLV RT 对温度敏感，应-20°C 保存直至步骤 1 需用前才取出。
RNase 抑制剂（选用）
RNase
的蛋白抑制剂可与大多数 RNase 结合并抑制它们的活性，但并不影响 Mo-MLV RT 中的 RNaseH
活性。几家厂商销售这些抑制剂，并给以不同的商品名称。（如 Promega 公司产的 RNAsin 和 5prime→3prime 公司产的
Prime Inhibitor)，详见第 7 章信息栏“RNases 抑制剂“。
核酸和寡核苷酸
dNTF 溶液，含有所有四种 dNTP，每种浓度为 5 mmol/L
用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物（1mg/ml)
通常用随机六核苷酸和 oligo(dT）12~18 或者这两种引物的混合物引发 cDNA 第一链的合成。对定向克隆, 通常使用引物-衔接子，其一般结构为 5'P(dX)-(dR)-(dT)x-OH3', 这里 X 由 4 个核苷酸组成（通常为 GAGA)，R 为限制性内切梭酸酶识别位点，（dT)x 为用于定向克隆的由 15(dT) 残基组成的多聚物。Oligo(dT)12-18 以 10 倍（Mo-MLV H-) 和 40 倍（Mo-MLV) 过量的摩尔数存在于第一链合成的反应混合物中，与随机六聚体和引物-衔接子（见下文）不同，Oligo(dT)12-18在反应混合物中的浓度通常不需要优化。随机六聚体在反应混合物中的浓度是很关键的。随着六聚体与
mRNA 比率的增加，cDNA 平均长度随之减少。所以在一系列含有放射性标记 dCTP 的预备实验中优化随机引物和 mRNA
模板的比例是必需的。在每一个预备实验中所产生的 cDNA 第一链的平均长度应当用巳知分子质量大小的 DNA
参照物作对照，通过碱性琼脂糖凝胶电泳和放射自显彩进行检测，当扩大规模大量合成 cDNA 第一链时，要使用能产生最大 cDNA
平均长度的最高随机引物与 mRNA 比。
使用引物-衔接子一般比使用随机引物引起的麻烦少，但是在一系列含有放射性标记的 dCTP
的预实验中，仍然需要慎重地优化引物-衔接于与 mRNA 模板的比例，每一反应中所合成的 cDNA 量按照本方案步骤 5 和 6
所述方法进行测量。当扩大规模大量合成 cDNA 第一链时，要使用能产生最大产量 cDNA 时的最低引物-衔接子与 mRNA 比。
制备引物贮存液（1 mg/ml,10 mmol/LTris-HCl[pH7.4] 配制），将溶液分装，贮存在-70°C。
poly(A)+RNA(1 mg/ml)
合成足量双链 cDNA 以构建大的文库时，一般需要 5~10ug poly(A)+RNA(—个 90 mm 大小的方瓶，培养哺乳动物细胞长成致密单层可产生 1~2ug poly(A)+RNA)。如果棋板用量较少，仍可有效地进行合成反应，但方案中毎一阶段 cDNA 的损失将成比例增加。当用有限数量的细胞制备文库时，参见本章末信息栏“从少量细胞构建 cDNA 文库"。
在开始构建
cDNA 文库前，应当用下述方法对所用 poly(A)+RNA 的完整性进行检査。（1）琼脂糖凝胶电泳和用对照探针进行 Northern
杂交（见第 7 章方案 5 和 8）。（2）在无细胞翻译系统中进行翻译，对产生的多肽进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。（3）对预实验反应中合成的
cDNA 第一链的大小进行分析 (见本方案末疑难解答“cDNA 第一链合成的优化”）。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dATP 和 [a-32P]dTTP 作为监视 cDNA 第一链和第二链合成的放射性示踪剂，因为它们偏爱掺入到对应 mRNA3'端 poly(A)+尾的 cDNA 中。在本方案中，不要使用贮存超过两周的 [a-32P]dCTP。
在开始本方案前，才能冻融 [a-32P]dCTP, 将融化的放射性标记的 dCTP 存放在冰上直到步骤 2 需用时。使用后必须立即将放射性标记的 dCTP 放在冷冻室内。
重要：Stratagene
产的 cDNA 合成试剂盒中推荐，在其方案中除不能用 dCTP 外，任何标记物都可以使用。试剂盒内的 dNTP 混合物中含有 5-甲基
dCTP, 这样可保护cDNA 内郁的 XhoⅠ识别位点不被 XhoⅠ降解，因为 XhoⅠ常用来产生供连接用的 XhoⅠ末端。在
Stratagene 公司的方案中使用放射性标记的 dCTP, 可在 cDNA 内部产生不能被保护的 XhoⅠ位点。
专用设备
微量离心管，无 RNase
预设温度为 16°C 和 70°C 水浴
附加试剂
本方案步骤 5 所需试剂列在第 5 章方案 8。
方法
1. 在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行 cDNA 第一链的合成:
poly(A)+RNA(1ug/ul) 10ul
寡核苷酸引物 (1ug/ul) 1ul
1mol/LTris-HCl(pH8.0,37°C) 2.5ul
1mol/LKCl 3.5ul
250 mmol/LMgCl2 2ul
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 毎种 5 mmol/L) 10ul
0.1mol/LDTT 2ul
RNase 抑制剂（选用） 25 单位
加 H2O 至 48ul
然后在反应物中，加人厂商推荐的 Mo-MLV H- RT 的用量，温和振荡混合反应物反转录酶是用含 Triton X-100 或 NP-40 和 50% 甘油的缓冲液配制的，因此避免气泡产生有时是困难的，但应尽量避免产生气泡，必要时，可用微量离心机稍稍离心一下，除去气泡。
Mo-MLV RT 对温度敏感，应保存在-20°C。直到需要使用为止。
重要：如使用 AMV RT 制剂，反应条件见表 11-3。
2. 当所有反应组分在 0°C 混合后，取出 2.5ul 反应液转移到另一个 0.5 ml 微量离心管内。在这个小规模反应管中加入 0.1ul[a-32P]dCTP(400Ci/mmol,10mCi/ml)。
3. 大规模和小规模反应管都在 37°C 温育 lh。
对于某些 Mo-MLV RT 突变体，可采用较髙的温度（高至 55°C）。若 mRNA 含有广泛的二级结构，较高的温度下反应能增加 cDNA 合成的产量。然而，在 55°C 合成的 cDNA 平均长度较在 37°C 合成的短。
4. 温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入 1ul 0.25mol/LEDTA, 然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在 70°C 温育 10 min, 然后转移至冰上。
在大规模反应管中所合成的 cDNA 可直接用作 PCR 反应的模板。如果 cDNA 第一链用作合成 cDNA 第二链的模板，应在进行步骤 5 和步骤 6 同时，准备好第二链合成所需材科和 16°C 水俗。
5. 按附录 8 所述方法，测定 0.5ul 小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸 (TCA) 沉淀的放射性活度。此外，用合适的 DNA 分子质量参照物通过械性琼脂糖凝胶电泳（参阅第 5 章方案 8) 对小规模反应产物进行分析是值得的。
cDNA 第一链应呈大小约 0.7kb 到 6kb 以上的拖影，多数在 2kb 左右。
小规模反应残留物保存在-20°C。
6. 按下述方法计算 cDNA 第一链的合成量：
a. 在大规模 cDNA 合成反应中，使用 10ul 含有 4 种 dNTP 的溶液，每种 dNTP 浓度为 5 mmol/L(即 10ul 20 mmol/L 总 dNTP) 所以大规模反应中必定含有
20nmol/ul dNTPx10ul=200nmol dNTP
b. 因为渗入到 DNA 中的每种 dNTP 的分子质量大约是 330 g/mol, 因此反应所能产生的 DNA 总量为：200nmolX330ng/nmol=66ugDNA。
c. 根据小规模反应的结果，计算所得 cDNA 第一链合成量为
如反应良好，cDNA 第一链的产量应是反应混合物中所用 poly(A)+RNA 量的 30%~40%。
另一种监视 cDNA 第一链合成情况的方法是在上面所述的大规模反应中，加入少量 [a-32P]dCTP(总量为 10uCi)。在随后 cDNA 的第二链合成反应中，加入更大量的放射性标记的 dNTP, 总置为 100uCi,—般不希望采用这种方法，因为随后必须将碱性琼脂糖凝胶于 X 射线胶片上长时间曝光以获得 cDNA 第一链产物的合适成像。
7. 尽可能快地进行 cDNA 合成的下一步骤
阶段 2:cDNA 第二链的合成
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
氯仿
EDTA(0.5mol/LpH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
(NH4)2SO4(1mol/L)
将 1.3 g 固体硫酸铵溶解于终体积为 10 ml 的水中，溶液经滤膜过滤除菌后，贮存于室溫。
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD)(50 mmol/L)
将 33.2 mg β-NAD 溶解于 1 ml 水中，制成 50 mml/L 的贮存液，分装后贮存于-70°C。β-NAD 除可作为电子受体外，也是大肠杆菌 DNA 连接酶的辅因子。不要将其与α-NAD 混为一谈。
酚：氲仿（1:1，V/V)
RNase H 缓冲液（选用）
20 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)
20 mmol/L KCl
0.1 mmol/L EDTACpH8.0)
0.1 mmol/L DTT
只有进行步骤 1 的备选步骤时，方需使用此缓冲液，
乙酸钠（3mol/L,pH5.2)
10XT4 多核苷酸激酶缓冲液
TE(PH7.6)
Tris-HCl(2mol/L,pH7.4)
酶和缓冲液
T4 噬菌体 DNA 聚合酶（2.5 单位/ul)
T4 噬茵体多核苷酸激酶（30 单位/ul)
大肠杆菌 DNA 连接酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I
RNase H
有数家厂商出售来自大肠杆菌的 RNase H 纯品，其比活需达到约 1000 单位/ml。
核酸和寡核苷酸
dNTP 溶液（含有 4 种 dNTP, 每种浓度为 10 mmol/L)
cDNA 第一链
使用按本方案步骤 1 制备的第一链大规模反应混合物。
参照物
见本方案末疑难解答"cDNA 第二链合成的优化"。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dTTP 作为监视 cDNA 第二链合成的放射性示踪剂。因为它们可能偏爱掺入到对应于 mRNA3'端 poly(A)+尾巴的第二链部位。
在开始本方案前，才能融化 [a-32P]dCTP, 将融化的放射性标记的 dCTP 存放在冰上直到步骤 1 需用时。使用后必须立即将放射性标记的 dCTP 放在冷冻室内。
专用设备
SephadexG-50 离心柱
将知
Sephadex G-50(中等大小孔径）加到无菌水中（10 g 干粉产生 160 ml
悬浆）。用无菌水清洗膨胀的树脂数次以除去可溶的葡聚糖，否则在乙醇沉淀时由于沉淀可造成问题。最后用含有 10 mmol/L NaCl 的
TE(pH7.6) 溶液平衡树脂，高消毒 [10 psi(0.70 kg/cm3)15 min] 并储存于室温。预装好的 Sephadex 柱和其他凝胶过滤树脂有商品销售。
预设温度为 16°C 的水浴
方法
用
RNaseH 和 DNA 聚合酶 I 催化合成 cDNA 第二链会导致 mRNA 模板 5'端序列的缺失（约 20 个核苷酸)。这是因为在
DNA 聚合酶 I 起始合成第二链前，RNaseH 降解了 mRNA-DNA 杂合体的 5'序列（D'Alessio and Gerard
1988)。大多数真核 mRNA 的 5'端含有一大段非翻译序列，因此缺失相当于 5'端 20 个核苷酸的 cDNA
克隆对大多数研究者将不会产生有害结果。另外，对于那些对 5'端序列非常关心的研究者，我们提供了一种步骤 1 的备选方法，可减少 cDNA
克隆失去 5'端的危险。不幸的是，这种方法可导致双链 cDNA 产量降低，所以大多数研究者愿意选择步骤 1 的标准方法。
1. 将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中（阶段 1, 步骤 4):
10 mmol/L MgCl2 70ul
2mol/LTris-HCl(pH7.4) 5ul
10mCi/ml[a-32P]dCTP(400Ci/mmol) 10ul
1mol/L(NH4)2SO4 1.5ul
RNase H(1000 单位/ml) 1ul
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I(10000 单位/ml) 4.5ul
温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机内稍离心，以除去所有气泡。在 16°C 温育 2~4 h。
2. 温育结束，将下列试剂加到反应混合物中；
β-NAD(50 mmol/L) 1ul
大扬杆菌 DNA 连接酶 (1000~4000 单位/ml) 1ul
室温温育 15 min。
3. 温育结束，加入 1ul 含有 4 种 dNTP 的混合物（每种浓度为 10 mmol/L）和 2ul(5 单位）T4 噬菌体 DNA 聚合酶。反应混合物室温温育 15 min。
4. 取出 3ul 反应物。按步骤 7 和步骤 8 描述的方法测定第二链 DNA 的质量。
5. 将 5ul0.5mol/L EDTA(pH8.0) 加入剩余的反应物中，用酚: 氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在 0.3mol/L(pH5.2) 乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收 DNA, 将 DNA 溶解在 90ul TE(pH7.6) 溶液中。
6. 将下述试剂加到 DNA 溶液中：
10XT4 多核苷酸激酶缓冲液 10ul
T4 多核苷酸激酶（3000 单位/ml) 1ul
室温温育 15 min。
7. 测定从上面步骤 4 取出的 3ul 反应物中放射性活度，并按附录 8 所述方法测定 1ul 第二链合成反应产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8. 用下面公式计算第二链反应中所合成的 cDNA 量。要考虑到已掺入到 DNA 第一链中的 dNTP 的量。
这里 x 表示 cDNA 第一链量（来自阶段 1 步骤 6)。DNA 第二链合成量通常为第一链量的 70%~80%。
9. 用等量酚: 氯仿对含有磷酸化 cDNA(来自步骤 6) 的反应物进行抽提。
10.Sephadex G-50 用含有 10mmol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的 dNTP 和 cDNA 分开（见附录 8)。
11.
加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和 2 倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的 cDNA, 将样品置于冰上至少 15
min, 然后在微量离心机中以最大速度 4°C 离心 15 min, 回收沉淀 DNA。用手提微型监测仪检査，是否所有放射性都沉淀下来。
12. 用 70% 乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13. 小心吸出所有液体（检查吸出的液体中是否完全没有放射活性)，空气干燥沉淀物。
14.
如果霈要用 EcoRI 甲基化酶对 cDNA 进行甲基化，可将 cDNA 溶解于 80ul TE(pH7.6) 溶液中（见本方案步骤
3)。另外，如果要将 cDNA 直接与 Not I 或 Sal I 接头或寡核苷酸衔接子相连（见本方案步骤 4), 可将 cDNA 悬浮在
29ulTE(pH7.6) 溶液。
沉淀的 DNA 重新溶解后，尽快进行 cDNA 合成的下一步骤。
在 cDNA 文库构建过程中，需多次采用乙醇沉淀 cDNA。因为 cDNA 量常常非常少（经常非常珍贵)，所以必须特别小心，以求 cDNA 回收比例达到最大。有关这方面建议，见附录 8。
阶段 3:cDNA 的甲基化
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
氯仿
10XEcoRⅠ 缓冲液
1XEcoRⅠ 甲基化酶缓冲液（选用)
如希望，可替代步骤 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
NaCl(5mol/L)
酚：氯仿
S-腺苷甲硫氨酸
用一级碘盐，预制含 5 mmol/L 硫酸和 10% 乙醇的贮存液（20 mmol/L）, 分装-20°C 保存。当购买 EcoRI 甲基化酶时，New England Biolabs 公司提供 S-腺苷甲硫氨酸溶液。
乙酸钠（3mol/L,pH5.2）
TE(PH8.0)
Tris-HCl(2mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
EcoRl
EcoRI 甲基化酶
New England Biolabs 公司销售的酶分离自带有可表达甲基化酶基因多拷贝质粒的大肠杆菌菌株。
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)(见步骤 8)
核酸和寡核苷酸
双链 cDNA
使用按本方案阶段 2 步骤 14 所制备的 cDNA。
线性化质粒 DNA 或λ噬菌体 DNA 两者中任何一种可用来检査
EcoRⅠ 位点甲基化效率，线性化质粒在离其末端有一段距离处至少有一个 EcoRⅠ 位点。λ噬菌体 DNA
可像在琼脂糖凝胶电泳中用作分子质量标准物（如 HindⅢ消化的λDNA) 一样加以使用，对于质粒 DNA, 用 PstⅠ将 1ug DNA
完全消化，通过酚：氯仿柚提和乙醇沉淀纯化 DNA。DNA 溶于 5ul TE(pH7.6) 溶液，-20°C 保存。
专用设备
预设温度为 68°C 的水浴。
方法
1. 在 cDNA 样品（来自阶段 2, 步骤 14) 中加入以下试剂
2mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5ul
5mol/L NaCl 2ul
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 2ul
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1ul
加 H2O 至 96ul
2. 取出两小份样品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量离心管中，分别编为 1 号和 2 号，置于冰上。
3. 在余下的反应混合液中加人甲基化酶（80000 单位/ml), 保存在 0°C 直至步骤 4 完成。
4. 再从大体积的反应液中吸出另外两小份样品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量离心管中，分别编为 3 号和 4 号。
5. 在所有四小份祥品中（来自步骤 2 和步骤 4) 加入 100ng 质粒 DNA 或 500ng 的λ噬菌体 DNA(按材料中所述方法制备）。这些未甲基化的 DNA 在预实验中用作底物以测定甲基化效率；
重要：在大体积反应中不要加入任何 DNA!
6. 所有四份小样实验反应和大体积的反应均在 37°C 温育 lh。
7. 于 68°C 加热 15 min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。
8. 在大体积反应液中加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和 2 倍体积的乙醇, 混匀后贮存于-20°C 直至获得小样反应结果。
9. 按下述方法分析 4 个小样对照反应：
a. 在每一对照反应中分别加入：
0.1mol/LMgCl2 2ul
10xEcoRⅠ缓冲液 2ul
加 H2O 至 20ul
b. 在 2 号和 4 号反应管中分别加入 20 单位 EcoRⅠ。
c. 四个对照样品于 37°C 温育1h, 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析。
琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色后，可见
cDNA 呈弥散的背景。甲基化的 DNA(管 3 和管 4 中的质粒 DNA 或λ噬菌体 DNA) 应对
EcoRⅠ降解有抗性，其大小不会改变；未甲基化的 cDNA 及管 1 和管 2 中的质粒或λ噬菌体 DNA 应该被
EcoRⅠ降解《如果确实_此，可继续进行第 10 步；否则须重复甲基化反应。
10.(接步骤 8) 微量离心机以最大速度离心 15 min(4°C) 以回收沉淀 cDNA。弃上清，加入 200ul70% 乙醇洗涤沉淀，重复离心。
11. 用手提式微型探测器检査是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将 DNA 溶于29ulTE(PH8.0)。
12. 尽可能快地进行 cDNA 合成的下一阶段。
阶段 4: 接头或衔接子的连接
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度
ATP(10 mmol/L)
5XT4 噬菌体 DNA 聚合酶修复缓冲液
90 mmol/L(NH4)2SO4
0.33mol/LTris-HCl(pH8.3)
33 mmol/LMgCl2
50 mmol/Lβ-疏基乙醇
将缓冲液分装，贮存于-20°C。
溴酚兰（0.25%w/v,50% 甘油配制）
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿
乙酸钠（3mol/L,pH5.2)
TE(pH8.0)
Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
T4 噬菌体 DNA 聚合酶
限制性内切核酸酶
取决于所用接头或衔接子的类型，如 EcoRI，NoeⅠ,SalⅠ或其他的限制性内切核酸酶
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)
见步骤 12。
核酸和寡核苷酸
cDNA, 未甲基化的或甲基化的
使用在本方案阶段 2 步骤 14 或阶段 3 之歩驟 13 中制备的 cDNA。
对照 DNA
见步骤 10 提示。
dNTP 溶液，含有四种 dNTP, 每种浓度为 5 mmol/L
线性化质粒 DNA 或λ噬菌体 DNA
合成的接头或衔接子
专用设备
SephadexG-50 离心柱
将
SephadexG-50（中等大小孔径）加到无菌水中（10 g 干粉产生 160 ml
悬浆)。用无菌水淸洗膨胀的树脂数次以除去可溶的葡萄糖，否则在乙醇沉淀时由于沉淀可造成问题。最后用 TE（pH7.6) 溶液平衡树脂，高压消毒
[10psi(0.70 kg/cm3)15 min] 后室溫保存，預装好的 Sephadex 柱和其他凝胶过滤树脂有商品销售。
预设温度为 16°C 和 68°C 水浴。
方法
cDNA 末端的削平
1.cDNA样品（来自步骤 11)于 68°C 加热5 min。
这一步骤是使cDNA分子的单链突出端可能形成的双链结构发生变性。
2. 将cDNA溶液冷却至37°C并加入下列试剂：
5xT4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10ul
dNTP溶液, 每种5 mmol/L 5ul
加H20 至50ul
3. 加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml),37°C温育15 min。
4. 加入1ul0.5mol/LEDTA(pH8.0), 以终止反应。
5. 用酚: 氯仿抽提，再通过Sephadex G-5O离心柱层析，除去未掺入的dNTP(见附录8)。
6. 在柱流出液中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2)和二倍体积的乙醇，样品于 4°C至少放置15 min。
7. 在微量离心机上以最大速度离心15 min(4°C)，回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后溶于13ul的10 mmol/LTris-HCl(pH8.0)。
接头-衔接子与cDNA的连接
8. 将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 2ul
800~1000ng的磷酸化接头或衔接子 2ul
T4噬菌体DNA连接酶(105Weiss单位/ml） 1ul
10 mmol/LATP 2ul
混匀后，在16°C温育8~12 h。
采用摩尔数大大过量（>100 倍）的接头是为了确保 cDNA末端与接头相连，而非 cDNA 之间相互连接。
9. 从反应液中吸出 0.5ul 贮存于4°C, 其余反应液于68°C加热 15 min 以灭活连接酶。
接头-衔接子的限制性内切核酸酶消化
如果限制性内切核酸酶的消化对于 cDNA 与载体的连接是必须的，那么需要继续进行步骤 10~12。否则省却步骤 10~12 直接进行步骤13。有关详细信息，请阅读本方案的导言。
10. 在加热后的连接反应中加入：
10x 限制性内切核酸酶缓冲液 20ul
H20 150ul
限制性内切核酸酶 200 单位
0°C 混匀。
对照管：取 2ul 反应液转移至 0.5 ml 的微量离心管中，再加入 100ng 对照 DNA(体积不超过 0.5ul), 可以是线性质粒。也可是经切割的菌体 DNA 制品。DNA 内部应含有所用的特殊的限制性内切核酸酶切位点。
11. 大体积反应和对照反应一并置于 37°C 温育 2 h。
12. 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析对照样品及在步骤 9 中吸出的 0.5ul 样品。在 1 或 2 条凝胶电泳道中加入质粒或λ噬菌体 DNA 分子质量标准对照。
如果连接反应良好，连接的接头在凝胶底部应呈片状条带。如果限制性内切梭酸酶消化完全，呈片状条带的接头应消失。对照样品中的质粒或λ噬菌体
DNA 应被合理切割。cDNA 与衔接子连接后，cDNA 大小不会有明显改变，所以当使用衔接子时可省去凝胶电泳对样品的分析。用于分级分离的
CDNA 的制备
13. 通过酚：氯仿抽提和乙醇沉淀的方法纯化 cDNA,cDNA 溶于 20ulTE 液中 (pH8.0)。
14. 加入 2.5ul 的 0.25% 溴酚兰溶液（50% 甘油配制），这将会使 cDNA 文库在下一步通过 SepharoseCL-4B(步骤 5) 分级分离时相对简单化。
阶段 5:SepharseCL-4B 凝胶过滤法分离 cDNA
材料
缓冲液和溶液
乙醇
乙酸钠（3 ml/L,pH5.2)
TE(pH7.6)
含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)
Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)
见步骤 8。
核酸和寡核苷酸
cDNA
阶段 4 中步骤 13 及 14 制备的 cDNA。
DNA 参照物
DNA 参照物应为末端标记的片断，长度 200bp~5kb。
专用设备
过滤的压缩空气
止血器或软管夹
带有弯头的皮下注射针头
1 ml 无菌吸管
聚乙烯管
剪刀
Sepharose CL-4B
用含有
0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 对市售糊状 Sepharose CL-4B
清洗数次。这种清洗可以去除存留在某些批号凝胶中的连接抑制剂。Amershan Pharmacia 生物技术公司提供已经装填好的
Sepharose CL-4B 柱 (Sizesep400 离心柱)。
乙烯基泡沫管
Whatman3 MM 滤纸
方法
Sepharose CL-4B柱的制备
1. 用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1 ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。
2. 将一段无菌的聚氯乙烯软管（通常用于蠕动泵的管型）与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1mol/LNaCl 的TE(PH7.6)溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。
3.
在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，0.1mol/L氯化钠的TE(pH7.6)平衡了的SepharoseCL-B填充于泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的SephamseCL-4B,
直至填充基质几乎充满吸管为止。
柱子直径应约为 27x0.3 cm。
4. 将几倍柱床体积的含0.1mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。
依据大小分离回收DNA
5.
用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50ul或更小)，放开止血钳，使
cDNA进入凝胶。用50ul TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA
的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1mol/LNaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
重要: 任何时候都不可使柱子流干！
6. 用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管二滴（约60ul), 直至将所有放射性洗脱出柱为止。
7. 用切仑科夫（Cerenkov)计数器测量每管的放射性活性。
8. 从每一管中取出一小份（约以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb)的 DNA片断作标准参照物，通过1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20°C，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。
制备的琼胞糖凝胶应尽可能薄以便加快电泳完成后干燥的过程。
标准DNA参照物中放射性量应是cDNA峰值放射性量的 30%。
9. 电泳后将凝胶移至一张Whatman3 MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器（市售）上干燥。干燥过程前20 min至30 min于 50°C加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥l~2 h。
10. 置-70°C加增感屏对干燥的凝胶继续X射线片曝光。
柱洗脱早期收集的部分，放射性自显影应显示cDNA大小为5~7kb的片状放射性：随后收集的 cDNA越来越小。
11.
在cDNA长度>500bp 的收集管中，加入 0.1 倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和二倍体积的乙醇。于 4°C 放置至少
15 min 使cDNA 沉淀，用微量离心机于 4°C 以 12000 g 离心 15 min, 以回收沉淀的 cDNA。
选择分级收集一定要十分谨慎，切不可选取含有痕量小于500bp 的cDNA的收集管。否則，文库中将含有数量很大的短 cDNA 链克隆。
12. 将 DNA 溶于总体积为20ul的 10 mmol/LTris-HCl(pH7.6) 中。
13. 测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于与噬菌体臂相连接的DNA 总量 (有关 cDNA 第二链的计算，参见阶段 2 步骤 8)。
如果一切顺利，10ug poly(A)RMA 至少可产生 250~400ng(可能髙至 3ug) 的长度大于 500bp 的 cDNA。
阶段 6:cDNA 与λ噬菌体臂的连接
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
ATP(10 mmol/L)
SM
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 连接酶
凝胶
琼脂糖凝胶（1%)
见步骤 8。
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