| 实验步骤 |
试剂
可以从多数大供应商那里买到该过程所需要的材料与合适的 5X 酶反应缓冲液或
10X 酶反应缓冲液。SuperscriptⅡ逆转录酶和 RNA 酶 H 可以从 Invitrogen 买到，RNasin 可以从
Promega Biotech 买到，Hercules 热稳定性 Hot-StartDNA 聚合酶可从 Stratagene 买到，Tdt 可从
Invitrogen 或 BoehringerMannheim 买到。按照供应商的说明使用酶。有多种不同的热稳定性 DNA
聚合酶，任何一种都是可用的，研究者应该寻找最有效的扩增（参照可靠性或价格）。来自 BoehringerMannheim
的方案是另一个很好的选择。图 25-2 的注解中列出了寡核苷酸引物序列，除QT 需要纯化以确保它们全都是全长序列外（大部分引物合成公司都提供这一服务），其他引物都可以「不加工」使用。100mmol/L 的 dNTP 溶液可以从很多供应商处买到。
这一实验方案分为两个阶段。
第 1 阶段：反转录产生 cDNA 模板
第 2 阶段：扩增
第 1 阶段：反转录产生 cDNA 模板
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 各 10 mmol/L)
二硫苏糖醇（DTT)(0.1mol/L)
TE(10 mmol/L Tris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和缓冲液
反转录缓冲液，5X(制造商提供）
RNA 酶 H
RNasin
SuperScriptⅡ逆转录晦（Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
poly(A)+RNA 或总 RNA
QT 引物（100ng/ul)
4. 特殊设备
预设为 37°C、42°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加热仪
二、方法
1. 在一个无菌的离心管中，于冰浴上混合以下转录成分。
反转录缓冲液，5X 4ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1ul
DTT(0.lmol/L) 2ul
Qt 引物（100ng/pl) 0.5ul
RNasin(40U/ul) 0.25ul
2. 在另一个管中，加1ul Ply(A)+RNA 或 5ug 总 RNA 至 13ul 水中，80°C 温育3 min, 迅速在冰上冷却，在离心机中离心 5s。
优先选用 Ply(A)+RNA 进行反转录，以降低反应背景，但如果仅有总 RNA，也没有必要制备 poly(A)+RNA。
3. 将 RNA 加入到反转录组分中，然后加1ul(200U) 的 Superscript Ⅱ逆转录酶，室温溫育 5 min,42°C1h,50°C10min。
4.70°C 溫育 15 min, 使逆转录酶失活，离心 5s。
5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H，37°C 温育 20 min, 以消化 RNA 模板。
6. 用 TE 将反应混合物稀释到 1ml，4°C 保存（这就是 3'末端 cDNA 文库）。
第 2 阶段：扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 各 10 mmol/L)
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和缓冲液
Hercules Hot-Start 聚合酶 (Stratagene)
Hercules Hot-Start 聚合酶缓冲液（10X)
3. 核酸和寡核苷酸
由第 1 阶段得到的 3'端 cDNA 文库
寡核苷酸引物 Q0、Q1、GSP1 和 GSP2(25pmol/L)(Q0 和 Q1 见图 25-2)
4. 特殊设备
可设程序的热循环仪
二、方法
1. 第一轮
(1) 在一个无菌的 0.2 ml 离心管中，混合以下成分。
Hercules Hot-Start 聚合酶缓冲液（10X) 5ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1.0ul
HerculesHot-Start 聚合酶 2.5U
H2O 至 50ul
(2) 加 1ul 的 3'末端 cDNA 文库（来自第 1 阶段第 6 步），GSP1 和 Q0 引物各 25pmol。
(3) 混合均匀，在一个 DNA 热循环仪上 98°C 加热 5 min，使第一链产物变性并激活聚合酶。冷却至合适的温度（56~68°C) 退火 2 min，72°C 延伸 40 min。
(4) 按下列程序进行 30 轮扩增循环。
2. 第二轮
(5) 用 TE 以 1:20 稀释第一链的部分扩增产物。
(6) 用上面的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 min 的延伸步骤，用 Q1 引物和GSP2 引物扩增 1ul 上述稀释材料。
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