酶活性的测定实验

1.酶的量或浓度可以用摩尔量表示，或者用酶单位的活性表示。

酶活力=每单位时间转化的底物摩尔数=速率×反应体积。酶活性是存在的活性酶量的量度，取决于指定的条件。SI单位是katal，1 katal = 1 mol /s，更实际的和常用的值是酶单位（U）= 1μmol/min。1 U对应16.67 nanokatals。

酶的比活力是另一种常见的单位，代表酶的纯度。用每毫克蛋白质所含的酶活力单位数来表示。比活力=活力U/mg蛋白。

反应的速率是每单位时间的底物消失（或产物生成）的浓度。

如果已知100％纯酶的比活性，那么不纯的样品将具有较低的比活性，从而可以计算纯度。

2.为了检测一种酶的催化活性，有必要首先鉴定从底物 （S） 到产物 （P） 转化所包含的化学变化。迄今为止，在各种关于酶催化活性文章的相关论述中，最典型的分类方式是按照其所催化的化学反应的类型来进行的 （如氧化-还原、基团转移、消除、异构化、重排、缩合、竣化作用等）（FreyandHegeman，2007）。此外，还应该考虑是否存在机制相似的化学过程：①涉及小分子底物或大分子蛋白质或核酸;②在溶液中易于发生或需要膜结合组分才能进行;③逆反应进行到多大的程度。在任何情况下，酶的分析围绕着以可计量的方式将给定底物和相关产物的理化性质进行区分的能力来设计 （EisenthaUndDans0n,2002;Rossomando,1990）。在很大程度上，类似的活性检测方法已经应用于这些亚群中的各种酶。在以某种已有检测方法为基础来为下面两类酶首次设计检测方法时要慎重，即不同物种来源的同源酶或催化相关化学反应的不同的酶。酶活性检测的中心主题是确保初始速率的测定。为了重申这一要点，常见的和较好的做法是， 在具有小于等于 5% 产物转化的时间内测定反应物减少或产物生成的初始速率。这种做法可以给出在初始底物浓度条件下的最接近起始反应速率的值。

酶样品 底物

对硝基苯磷酸盐 二乙酸酯（FDA） MTT

分光光度计 荧光光度计 量热计 HPLC

连续测定是最方便的，一种测定给出反应速率，无需进一步的工作。有许多不同类型的连续测定。

1.分光光度法

在分光光度测定中，您可以通过测量测定溶液吸收的光量变化来跟踪反应过程。如果这种光在可见区域，您实际上可以看到测定颜色的变化，这称为比色测定。MTT测定，使用四唑染料作为底物的氧化还原测定法是比色测定法的一个例子。

通常使用UV光，因为常见的辅酶NADH和NADPH以其还原形式吸收UV光，但不以其氧化形式吸收。因此，使用NADH作为底物的氧化还原酶可以通过在消耗辅酶的情况下在340nm波长下的UV吸光度的降低来测定。[4]

2.直接偶联测定

使用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联测定己糖激酶。

即使当酶反应不会导致光的吸光度发生变化时，仍然可以通过使用偶联测定法对酶进行分光光度测定。这里，一次反应的产物用作另一种易于检测的反应的底物。

3.荧光

荧光是指分子在吸收不同波长的光后发出一种波长的光。荧光测定使用来自产物的底物荧光的差异来测量酶反应。这些测定通常比分光光度测定更灵敏，但是可能遭受杂质引起的干扰以及当暴露于光时许多荧光化合物的不稳定性。

这些测定的一个例子是核苷酸辅酶NADH和NADPH的使用。这里，还原形式是荧光的，氧化形式是非荧光的。因此，氧化反应之后可以通过增加来减少荧光和还原反应。也可获得在酶催化反应中释放荧光染料的合成底物，例如用于测定β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷。

4.量热

量热法是测量化学反应释放或吸收的热量。这些测定非常通用，因为许多反应涉及一些热变化并且使用微量热计，不需要太多的酶或底物。这些测定可用于测量不可能以任何其他方式进行测定的反应。

5.化学发光

化学发光是通过化学反应发光。一些酶反应产生光，这可以测量以检测产物形成。这些类型的测定可以是非常敏感的，因为产生的光可以在数天或数周内被照相胶片捕获，但是可能难以量化，因为不会检测到反应释放的所有光。

通过酶化学发光（ECL）检测辣根过氧化物酶是在蛋白质印迹中检测抗体的常用方法。另一个例子是酶萤光素酶，这种萤光素酶存在于萤火虫中并且自然地从其底物荧光素产生光。

6.光散射

静态光散射测量重均摩尔质量和溶液中大分子浓度的乘积。给定在测量时间内一种或多种物质的固定总浓度，散射信号是溶液的重均摩尔质量的直接量度，其随着络合物形成或离解而变化。因此，测量量化了复合物的化学计量以及动力学。蛋白质动力学的光散射测定是非常通用的技术，其不需要酶。

7.微尺度热泳

微尺度热泳（MST）测量平衡时分子/底物的大小，电荷和水合熵。荧光标记的底物的热泳运动在被酶修饰时发生显着变化。可以以高时间分辨率实时测量该酶活性。]全光学MST方法的材料消耗非常低，仅需要5μl样品体积和10nM酶浓度来测量活性和抑制的酶速率常数。MST允许分析人员一次测量两种不同基板的修改（多路复用））如果两种底物都用不同的荧光团标记。因此可以进行基质竞争实验。

测定中可能影响的因素：

1.盐浓度：大多数酶不能耐受极高的盐浓度。离子干扰弱离子键的蛋白质。典型的酶在1-500mM的盐浓度下具有活性。例如嗜盐 藻类和细菌。

温度的影响：所有酶都在生物体特有的温度范围内起作用。温度升高通常会导致反应速率增加。较高的温度会导致反应速率急剧下降。这是由于弱离子和氢键的分解导致的稳定了酶活性位点的三维结构的蛋白质结构的变性（改变）。人体酶的“最佳”温度通常在35到40°C之间。人类的平均温度是37°C。人体酶在高于40°C的温度下开始迅速变性。来自嗜热的酶 在温泉中发现的古菌在高达100°C时稳定。酶反应的“最佳”速率的想法是不合理的，因为在任何温度下观察到的速率是两种速率，反应速率和变性速率的乘积。

2.pH的影响：大多数酶对pH敏感并且具有特定的活性范围。都具有最佳pH值。pH可以通过破坏离子键和氢键使酶的三维形状变性（改变）来阻止酶活性。大多数酶的pH值在6到8之间; 然而，胃中的胃蛋白酶在pH值为2时效果最好，胰蛋白酶在pH值为8时效果最佳。

3.底物饱和度：增加底物浓度可提高反应速率（酶活性）。然而，酶饱和度限制了反应速率。当大多数时间所有分子的活性位点都被占据时，酶就会饱和。在饱和点，无论添加多少额外的底物，反应都不会加速。反应速率图将趋于稳定。

4.大分子拥挤的效应，溶液中的大量大分子的拥挤程度将改变酶反应的速率和平衡常数

常见的与酶测定有关的测定方法：

1.荧光素二乙酸酯（FDA）水解测定。

2.对硝基苯磷酸盐可介导 ELISA和常规分光光度测定。

3.MTT测定。