半乳糖苷酶活性的整体封片染色和免疫组化检测
准备大组织的厚切片进行β-半乳糖苷酶染色
实验方法原理 | |
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实验材料 | 小鼠或鸡的整个胚胎、组织或外植体 |
试剂、试剂盒 | 磷酸盐缓冲液(PBS) 冰冷 β-半乳糖苷酶固定剂 β-半乳糖苷酶洗涤缓冲液 β-半乳糖苷酶染色液 |
仪器、耗材 | 5 mL或10 mL的聚苯乙烯或聚丙烯帽盖的试管或1.5〜2 mL的离心管 转动平台 染色用密闭箱 附有盖玻片的下陷载玻片或箱式载玻片 纤光照明的解剖显微镜 显微照相仪 |
实验步骤 |
1)在冰冷的PBS里解剖胚胎或组织。置β-半乳糖苷酶固定剂,室温至合适的时间。以下是固定小鼠胚胎和组织的指导:外植体和E 6.5到E 7.5胚胎5〜10 min; E 8到E 9.5胚胎或尾巴切面 15〜30 min; E 10 到 E 12.5 胚胎 30 min〜1.5 h; E 13 到 E 14.5 胚胎 2 h; E 15.5 或更大的组织则需要解剖出来或切一半,然后固定2 h。新生幼鼠或更大的小鼠的灌注需要在解剖特定组织染色之前进行。 2) 用β-半乳糖苷酶洗涤缓冲液室温洗涤3次,每次15 min (针对小胚胎或尾巴切面), 或每次30 min (针对Ell胚胎和大组织),头尾相接地轻柔转动。 3) 将组织置于β-半乳糖苷酶染色液中(室温,30℃或37℃取决于β-半乳糖苷酶表达丰度),在一5 mL或10 mL的帽盖的试管或1. 5〜2 mL的离心管中孵育,以防止蒸发。可以用肉眼或解剖显微镜调节染色程度。 4) 得到预期的信号背景比之后(1〜48 h),在PBS中洗涤组织3次,每次30 min。 5) 通过解剖镜观察和拍摄样本染色的组织,使用低功率的物镜和来自侧面和顶端的光纤照明。为了得到最好的结果,将组织放置在附有盖玻片的下陷载玻片或箱式载玻片,用足够的PBS覆盖组织。
展开 |
注意事项 |
戊二醛、甲醛、脱氧胆酸钠、亚铁氰化钾和高铁氰化物、二甲基甲酰胺、Histoclear、苯 甲酸苄酯、苯甲醇和 Perniount 是危险物质。它们的操作和处理均需按照制造商的指导。
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其他 |
分离小鼠胚胎和鸡的胚、组织或外植体,部分固定以保持β-半乳糖苷酶的活性,彻底洗涤去除固定剂,如果有必要可厚切片,在显色底物存在的情况下染色。 接下来,染色组织整体封片照相,样本包埋,切片,显示报道基因的细胞和组织特异性表达。强烈推荐做预备试验,这样可以估计和标准化特定试验和组织的最优化条件 |
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