脐带和脐血的准备
从脐静脉分离干细胞
种植法从Wharton胶中分离干细胞
种植法从Wharton胶中分离干细胞
酶消化法从Wharton胶中分离干细胞
实验方法原理 | |
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实验材料 | 脐带 |
试剂、试剂盒 | 培养基:脐带运输培养基:Eagle基础培养基(EBM) 添加300 U mL青霉素 300 μg mL链霉素 150μg mL庆大霉素和lμg mL两性霉素B。 MSCs培养基:含2 mmol L的左旋谷氨酰胺的低糖DMEM(LG-DMEM) 添加10% 热灭活胎牛血清(FBS) 100 U mL青霉素和l00μg mL链霉素。 |
仪器、耗材 | 夹子 针头 注射器 |
实验步骤 |
(a)出生后,用两个夹子在近新生儿的末端和近胎盘的末端夹住脐带以封闭脐带; (b)剪下两个夹子间的脐带,一端在接近新生儿处,另一端剪去胎盘; (c)剪下脐带后放入运输培养基中送去实验室,整个处理过程在6〜12 h内。 (a)夹住脐带,尽可能靠近新生儿处剪断脐带。 (b)用Betadine或70%酒精的棉花擦拭针头插入位点,位点在脐带近胎儿末端。 (c)为了收集到最大量的脐血,脐带的处理动作要尽可能小。 (d)接着用收集袋或50mL注射器的针头插人步骤b中处理好的脐静脉插人位点。 (e)将收集袋保持在低于插人位点水平,以利于脐血在重力作用下流人容器中,或者用50mL注射器缓慢地将脐血从跻静脉内抽出。尽量多地收集脐血,一般能收集到60〜150mL。 (f)如果出现静脉滑脱,可沿脐带稍向上处用Betadine或70%乙醇消毒后重新插入针头。 (g)血流停止后,打开针头安全帽,将它推入锁定位置。注意:脐血应该保存于室温,不要冷藏。 (h)如果使用袋装,用附带的卡环夹住管子,尽可能接近血袋处打两个安全结以防止泄露,然后剪去针头,将针头放人尖头容器中丢弃。 (i)轻轻转动血袋或注射器几次,使脐血与抗凝剂充分混合
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注意事项 | |
其他 |
其他试剂: 灭活胎牛血清(FBS),100 U/mL青霉素和l00μg/mL链霉素。 用于造血干细胞的IMDM:含2 mmol/L的左旋谷氨酰胺的IMDM,添加1% 牛血清白蛋白,10μg/mL胰岛素,0.l mmol/L 2-巯基乙醇,50 U/mL青霉素和50μg/mL链霉素。 用于造血干细胞和MSCs共培养的IMDM:IMDM添加10% 热灭活FBS,100 U/mL青霉素和 100μg/mL链霉素。 用于脐带血来源多能祖细胞的DMEM:含2 mmol/L的左旋谷氨酰胺的高糖DMEM (HG-DMEM), 添加10% 热灭活胎牛血清(FBS),l00 U/mL青霉素,l00μg/mL链霉素和100 ng/mL粒细胞巨膝细胞-集落刺激因子(GM-CSF)。 PBSA:Dulbecco’sPBS溶液A(无钙镁离子)、过柱缓冲液:pH7.2的PBSA,添加0.5% 牛血清白蛋白和2 mmol/L EDTA或0.6%枸橼酸葡萄糖 A方(ACD-A)。用真空装置除去缓冲液中的气体。ACD-A: 枸橼酸葡萄糖A方(0.6%ACD-A)和0.5% 的牛血清白蛋白(第 V 组分)。胶原酶 A,0.1% 用 PBSA 配制胰蛋白酶,0.05% 胰蛋甶酶用 PBSA 配制,含 0.53 mmol/LEDTA;2.5% 胰蛋白酶用 PBSA 配制。抗凝血剂:枸橼酸葡萄糖腺苷(CPDA-1):122 mmol/L(26 g/L) 枸橼酸钠,0.142mol/L (25.5 g/L) 葡萄糖,15.6 mmol/L(3.0 g/L)枸橼酸和18.3 mmol/L(2.2 g/L)磷酸二氢钠。
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