振荡摇床法纯化培养少突胶质细胞实验

利用少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞生长存存时间上的差异，以及细胞生长方式、细胞对培养层黏附性不同等特性，用37℃恒温摇床从培养的混合胶质细胞中分离少突胶质前休细胞，然后再利用差速贴壁的原理用塑料培养皿或培养瓶除去纯化后污染的星形胶质细胞以获得高纯度的少突胶质细胞，并在体外诱导分化的条件下最终获得成熟的少突胶质细胞。

新生1-2d的SD大鼠仔鼠

DMEM培养液(l1960).DMEM F12培养液 胎牛血清 3. 胰岛素(16634).转铁蛋白(T2252) 谷氨酰胺(G8540) 丙酮酸钠(P2256).牛血清白蛋白(A9647) 硒酸钠(S5261) 氢化可的松(H0888) 三碘甲腺原氨酸(T-2752) NAC(A8199)、多聚鸟氨酸(P042l) DNase l(D5025)以上Sigma公司

培养瓶 37℃恒温摇床

原代培养来自于新生1-2d的SD大鼠皮层的少突胶质细胞。

依照总论的方法获得细胞悬液后，参考文献 (NatureProtocols,2007,2:I044-I051; Journalof Neuroscience Methods,2005,50-56) 介绍的方法，详细步骤如下。

1.在离心获得的细胞沉淀中，加入1.5ml的培养液并用小口径滴管轻柔重悬细胞，再用完全培养基(DMEM+10%胎牛血清+1mM的丙酮酸钠+4mM的谷氨酰胺+50U/ml青霉素）稀释，按照1.0x10⁵/cm²的密度接种于多聚赖氨酸包被的T75的培养瓶中，混匀后放入37℃,5%CO₂的孵育箱内培养。

2.接种2d之内尽量不要晃动培养瓶，培养4d后开始全量换液，以后每3d全量换液1次并注意镜下观察细胞融合度。

3培养至第7-9天时，星形胶质细胞已铺满瓶底，并且可见其上层有胞体小、折光高、有小突起的少突前体细胞出现，此时可以开始纯化细胞。

4先用摇床除去处于半悬浮生长的小胶质细胞(200r/min,37℃,约20min),然后快速全拯换液。

5换液过夜稳定后继续用摇床分离少突前体细胞(280r/min,37℃),18-20h后收集细胞悬液并使其通过200目的细胞筛网，然后再利用差速贴壁除去混入的星形胶质细胞和小胶质细胞（将过滤的细胞悬液接种于100mm培养皿[Corning, NY]内静置，每隔5min用手轻轻摇晃1次，连续持续30min),剩余培养瓶中的细胞可以加新鲜完全培养液继续培养3d,然后重复5的步骤。

6.收集培养皿中的细胞上清并计数，离心(1000r/min,5min)后弃上清，以少突前体细胞增殖培养基（无血清培养基Satomedium中添加10ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF)重悬细胞，并按照(3-4)x10⁴/cm²密度接种于多聚鸟氨酸包被的培养皿或玻片上，每天补充半量的增殖因子(PDGF-AA和bFGF)

7. 2-3d后细胞增殖至铺满培养皿时可用消化分离培养液(DMEM/F12中添加0.01%EDTA、0.2mg/ml DNase I溶液、5µg/ml胰岛素）消化细胞（直接吸弃培养液并加入少量消化液，手心中摇晃5-8min),利用含血清培养液终止消化，仔细吹打培养皿底部，使全部细胞脱落，然后收集细胞上清离心。

8.传代1次的细胞可以继续接种于增殖培养基中，也可以接种千分化培养基内［无血清培养基Satomedium中添加15nM三碟甲腺原氨酸(T3)、10ng/ml CNTF和5µg/ml NAC]开始诱导少突胶质细胞分化。此后每隔Id补充半量的促分化因子(T3、CNTF和NAC),在分化培养基中培养2d后可以获得未成熟的少突胶质细胞，在培养6d后可以获得成熟的少突胶质细胞。无血清培养基Satomedium制备：在DMEM/F12中添加4mM谷氨酸、0.1mM丙酮酸钠、0.1%BSA、50µg/ml转铁蛋白、5µg/ml胰岛素、30nM硒酸钠、10nM维生素H和10nM氢化考的松。少突胶质细胞的细胞体较星形胶质细胞和小胶质细胞的小，少突前体细胞的为双极突起，随着分化成熟，突起分支增多，呈蛛网状（图I-4)。在少突胶质细胞分化成熟过程中特异性表达一系列的标记物，从而可以根据不同的标记物鉴别少突胶质细胞及所处的分化阶段

1.选择新生1-2d的仔鼠培养少突胶质细胞。年龄稍微偏大的仔鼠中星形胶质细胞数量过多，偏小的仔鼠中神经元数量多，都不适宜培养少突细胞。

2.原代培养时接种的密度不宜过小（一般2-3只新生鼠皮层的细胞接种于一个T75的培养瓶中），否则很难获得足够数量的少突胶质细胞。

3用摇床单次纯化OPCs的时间不宜超过24h,否则容易导致细胞活性下降。

4.培养少突胶质细胞的无血清培养基中最好不要添加链霉素，有报道认为链霉素对少突胶质细胞的活性有一定的影响。另外配制的含各种神经因子的无血清培养基最好在2周内用完。

5少突胶质细胞在碱性环境中生长不佳，要注意CO₂孵育箱内的酸碱度。

1. 摇床震摇细胞过夜一般从下午或晚上开始，次日一大早应先观察细胞脱壁情况，防止时间过长下层细胞发生脱壁。

2. 小鼠的少突胶质细胞培养用该方法通常获得的少突前体细胞不易诱导分化为成熟的细胞，可以参考其他方法培养(NatureProtocols,2007,2:1044-I051)。

3. 少突胶质细胞是一种极易损伤、不易存活的细胞，在较为复杂的培养过程中要特别注意每个细节。目前用于诱导少突胶质细胞分化的无血清培养基的有DF12+Nl/N2+T3（少突胶质细胞在这种培养基中的存活时间短，需要的细胞接种密度高）、Neuro-basal medium+B27+T3（利于细胞存活，支持低密度接种的细胞，并且能够与神经元共培养，但是少突胶质细胞成熟的过程较慢）和Satomedium (少突胶质细胞独立培养最为公认的培养基，利于细胞的成熟分化）。可以根据各自的实验要求选择不同的培养方法。另外，少突胶质细胞成熟后在没有神经元轴突刺激的情况下，无法形成髓鞘，会逐渐凋亡而不会长时间存活。