黄柏为常用中药, 始载于《神农本草经》, 原名“檗木”, 具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效[1]。黄柏的主要药效成分为生物碱[2], 包括黄柏碱、药根碱、巴马丁和小檗碱, 临床上常用于降血压、抗心律失常、抗血小板聚集、降血糖、逆转肿瘤耐药性、抗氧化等[3,4]。
细胞药理实验是研究中药药效物质的重要手段, 因此研究细胞培养液中有效成分的变化, 能够为明确中药的药效、物质基础及作用机制提供理论依据[5]。而细胞培养液的分析存在样品基质复杂和有效成分含量低等问题[6], 需采取适当的分离、净化、富集等样品前处理技术,以增加检测的灵敏度和准确度, 同时降低对整个检测系统的污染。
固相萃取技术是目前应用较为广泛的一种样品前处理技术[7], 已应用于环境、化工、食品等多个领域[8]。采用固相萃取柱进行萃取时, 因其柱体积大、样品用量多, 难以用于血液、细胞培养液、组织液等微量生物样品的分析, 从而限制了该技术的应用[9]。因此, 固相萃取的微型化已成为该领域的研究热点[10]。移液枪头在实验室中应用广泛, 可通过内置固相萃取吸附剂, 同时实现采样、定量、净化和富集, 弥补传统生物样品前处理方法操作复杂、有机溶剂用量大、目标物易损失等技术缺陷[11, 12]。本文通过原位聚合法将聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体固定相内置于移液枪头内, 制成具有弱阳离子交换基团的固相微萃取(SPME)装置, 用于微量细胞培养液的前处理和生物碱的富集, 为进一步开展药效筛选和药理实验、科学合理地利用药用植物资源提供技术手段和科学依据。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
Ultimate 3000高效液相色谱(HPLC)仪、Orion 3-Star pH计、311型二氧化碳细胞培养箱、Reacti-ThermTS-18823氮吹仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司); DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司); KQ-400DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司); DJ-10A倾倒式粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司); YJ-40L超纯水机(杭州亚洁环保设备有限公司)。
黄柏碱(批次11062401)、药根碱(批次15050712)、巴马丁(批次16022614)和小檗碱对照品(批次15010411)均购自北京恒元启天化工技术研究院, 纯度>98%。乙二醇二甲基丙烯酸酯(纯度>97%)、甲基丙烯酸(纯度>95%)均购自日本东京化成工业株式会社; 异丙醇、1, 4-丁二醇、偶氮二异丁腈、无水乙醇、磷酸二氢钾、甲醇(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司; 乙腈(色谱纯)购自上海阿拉丁试剂有限公司; DMEM高糖细胞培养液购自吉诺生物医药技术有限公司。本实验用水均为二次去离子水(18.2 MΩ\5cm)。
1.2 整体柱的制备
采用原位聚合法制备聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱[13]。分别称取0.9 mL甲基丙烯酸(单体)、0.3 mL乙二醇二甲基丙烯酸酯(交联剂)、1.8 mL三元致孔剂(包括1.05 mL异丙醇、0.6 mL 1, 4-丁二醇和0.15 mL去离子水)、5.0 mg偶氮二异丁腈(引发剂)于10 mL烧杯中, 于冰浴中超声10 min, 混匀, 形成反应混合液。将500 μL反应混合液用移液枪迅速吸入经甲醇清洗过的2 mL移液枪头中, 用硅胶垫密封, 于60 ℃烘箱中聚合反应24 h后, 用无水乙醇和去离子水反复冲洗。
1.3 样品前处理
1.3.1 黄柏提取物的制备
采用热水提取法制备黄柏提取物。将黄柏药材干燥后粉碎, 称取50.0 g黄柏粉末于3 000 mL圆底烧瓶中, 加入1 000 mL水, 回流提取2 h, 共3次, 合并提取液, 减压蒸馏至干, 得到黄褐色固体状的黄柏提取物, 于4 ℃冷藏保存。称取100 mg黄柏提取物, 用细胞培养液溶解后, 过0.22 μm滤膜, 其生药含量为0.50 g/L。
1.3.2 固相微萃取
固相微萃取的整个过程均通过移液枪吸取溶液或样品(流程见图 1)。具体步骤,①活化整体柱:分别吸取1.0 mL甲醇和0.5 mL水冲洗整体柱; ②取样:吸入1.0 mL标准溶液或细胞培养液, 经8 min后排出; ③净化:吸取1.0 mL水后立即排出; ④洗脱:吸取1.0 mL氨水-甲醇混合溶液(18:82, v/v), 经10 min后排出; ⑤浓缩:收集洗脱液, 氮气吹干后, 用100 μL乙腈-磷酸二氢钾溶液(0.05 mol/L, pH 4)(90:10, v/v)溶解, 待HPLC分析。
1.3.3 细胞培养与给药
采用成骨细胞进行实验。细胞培养过程[14]:将新生乳鼠置于75%(v/v)乙醇溶液中浸泡10 min, 切下颅盖骨于无钙、镁离子的平衡盐溶液(D-Hanks液)内, 清除骨膜、血管等结缔组织, 用D-Hanks液洗净颅盖骨, 剪成1 mm×1 mm大小的骨片, 置于0.25%(质量分数)胰蛋白酶溶液, 消化30 min, 加入含10%(质量分数)胎牛血清(FBS)的完全培养基终止消化, 将消化后的颅盖骨片移入0.1%(质量分数)Ⅱ型胶原酶溶液中振荡30 min后, 以1 000 r/min离心10 min, 吸去上清液, 沉淀的细胞团块用培养液吹打成细胞悬液, 接种于培养瓶, 于37 ℃含有5%(v/v) CO2的培养箱中培养, 每2~3 d换液1次, 直至80%的细胞融合, 然后对细胞进行传代培养。在接种6 d的成骨细胞中加入1.5 mL 0.25%(质量分数)胰酶, 消化5 min, 加入等体积FBS培养基与胰酶, 以1 000 r/min离心5 min, 收集沉淀, 用培养液吹打成为合适浓度细胞液后, 接种于96孔板中, 培养24 h后,加入黄柏提取物溶液, 采集5 h、24 h的细胞培养液样品, 经0.22 μm滤膜过滤, 待SPME净化和色谱分析。
1.4 色谱条件
色谱柱为Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm); 柱温为30 ℃; 流动相为(A)乙腈-(B)磷酸二氢钾溶液(0.05 mol/L, pH 4);流速为1.0 mL/min。梯度洗脱条件:0~10 min, 90%B~80%B; 10~50 min, 80%B。进样量为20 μL; 紫外检测波长为270 nm。
1.5 标准溶液的配制
用乙腈-磷酸二氢钾(0.05 mol/L, pH 4)(90:10, v/v)混合溶液配制质量浓度为50、100、200、300、500、700、1 000 μg/L的黄柏碱系列标准溶液; 配制质量浓度为5、10、50、100、200、300、500 μg/L的药根碱和巴马丁系列标准溶液; 配制质量浓度为100、200、500、1 000、1 500、2 000、3 000 μg/L的小檗碱系列标准溶液。
2 结果与讨论
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