液相色谱法又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等,是色谱法的一个重要分支。这种色谱分析法以液体为流动相,采用高压输液系统,具有高压、高速、高灵敏度的特点,凭借检测范围广、样品需求量少、检验效果好的优点,成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。
这里小编就来介绍一下HPLC的维护与使用注意。
1.开关机操作注意
分析准备工作做好后,依次打开稳压电源、高压输液泵、柱温箱、检测器,待各部件自检结束,打开连接仪器的电脑,启动工作软件。分析工作结束后,关闭工作软件,再依次关闭检测器、柱温箱和高压输液泵。
2.对流动相的要求
为保证液相色谱仪器的正常使用,所有流动相必须是色谱级的,且经过过滤杂质、排除气泡后装入干净的流动相贮存瓶中待用。
(1)流动相的物理化学性能要求
对分析物要有足够的溶解能力,以利于提高检验的灵敏度;流动相的黏度要小,以保证合适的柱降压;流动相的沸点要低,以利于制备分离时样品的回收;流动相的 PH 值一般应在 2~7.5;使用期限不得超过 2 天,否则产生细菌污染管路。
(2)流动相的过滤
流动相在使用前都必须经过滤,以除去杂质微粒。同时要定期清洗吸滤头,以防杂质通过其进入流动相。应依据其是否是水溶性选择水膜或有机膜(0.45 μm 或 0.22 μm),使用溶剂过滤装置,通过真空泵抽气过滤。
(3)流动相的脱气
流动相必须预先脱气,否则易产生气泡,影响泵的工作。此外,溶解在流动相中的氧能与某些有机溶剂形成有紫外吸收的络合物,提高背景吸收,会在梯度洗脱时造成基线漂移或形成鬼峰。常有的脱气方法有在线真空脱气法、超声波脱气法、抽真空脱气法三种。
3.色谱柱的维护及使用注意事项
所有分析样品应把pH值调节到适合色谱柱的pH值范围内。进样要避免超负荷,这是保持色谱柱性能持久良好的重要方法之一。手动进样器进样的话,进样时动作要快速准确。分析物成分复杂时,要在色谱柱前加色谱保护柱以保护色谱柱。每次分析工作开始时,要对色谱柱进行平衡,用含10%流动相中的有机溶剂的水溶液进行排气和冲洗色谱柱和管路,冲洗30分钟左右,将色谱柱中的纯有机溶剂替换掉,然后再用至少10倍柱体积的流动相平衡色谱柱,直至基线平衡后方可进样。
每次分析工作结束后,一定要立即用一定量的水溶液彻底冲洗色谱柱中的缓冲盐液,再用对被测物洗脱能力强的溶剂来冲洗色谱柱,冲洗时间不能小于1小时,洗脱溶剂的用量至少为柱体积的20倍。若不及时冲洗色谱柱,杂质长时间积累在其中,易堵塞色谱柱,降低柱效性能。长期这样,会加速减少色谱柱使用寿命。色谱柱4天以上不使用,应从仪器上取下,用封头螺帽把两头紧紧密封。色谱柱保存时注意不要强烈震动、碰撞。
4.高压输液泵的维护及使用注意事项
每次分析工作结束后,都应及时清洗泵。当有缓冲盐做流动相时,缓冲盐与有机溶剂互相交换前一定要用5%的甲醇水溶液清洗泵,防止盐在有机相中结晶损坏泵中各组件。缓冲盐溶液的浓度不要过高,要控制在5%以下,否则高浓度的缓冲盐会磨损密封垫和活塞,降低其使用寿命。长时间使用高浓度的缓冲盐,必须用10%的异丙醇色谱级溶液清洗泵,从而保护柱塞和密封垫。
输液泵工作前要设置工作压力范围,正常工作压力一般不要超过 30 Mpa,否则经常高压会使密封环变形,产生漏液。平时分析工作要养成记录压力的好习惯,这样如果工作压力超过平时正常压力的10%~15%,就应及时查找原因。
5.紫外检测器的维护及使用注意事项
紫外检测器有一定的使用寿命,所以平时应尽量减少氘灯的使用时间,在柱平衡进行一大半之后,在走基线之前,打开检测器光源;分析结束后即可关闭检测器光源。要保持检测器四周环境清洁,实验室尽量少开窗户,定期地面进行吸尘工作,防止检测器工作时由于静电吸附灰尘颗粒覆盖在光学元件上。检测器池内存在气泡就会产生噪音,噪音会干扰定量分析,所以流动相须充分脱气后再使用。
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