实验材料
| 试剂、试剂盒 | |
|---|---|
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 在选好植物材料和匀浆缓冲液后，接下来关键的因素包括匀浆方法、缓冲液的 pH、使用的缓冲液与植物组织之间的比例、研磨时间及温度等（见注释 5) 。 3.1 匀浆 根据植物组织的不同可以采取不同的匀浆方法，或者几种匀浆法结合运用。 ( 1 ) 直接用预冷的研钵和研槌进行匀浆。 ( 2 ) 在烧杯中用 Moulinex 混合器匀浆 20~60s，或者用 Polytron 搅拌器在 50% 的全速下搅拌 5 次，每次 2s。 ( 3 ) 在陶瓷搅拌器中高速下搅拌 15s，或低速下搅拌 2 次，每次 15s。 ( 4 ) 用商用蔬菜或水果榨汁机将块茎直接榨汁到 5X 匀浆缓冲液中。 ( 5 ) 直接用搓板在匀浆缓冲液中将材料搓碎。  3.2 缓冲液 pH 以及与材料的比例 ( 1 ) 使用前匀浆缓冲液的 pH 必须调到 7.8 左右，以确保在细胞破碎后的整个系统 pH 仍能保持在 7.0~7.6。 ( 2 ) 对于某些特殊的植物组织，可能需要使用较多的匀浆缓冲液或者匀浆后使用 5 mol/L KOH 或 NaOH 调节以保证最后的 pH 在 7.0 以上。 ( 3 ) —般来讲，鲜重每克非绿色组织需用 2 ml 匀浆缓冲液，每克绿色组织则需用 4 ml。降低缓冲液的使用量会大大降低线粒体的提取效率。 ( 4 ) 在从块茎组织中提取线粒体时，使用较少的缓冲液也能有较高的提取效率，可能是因为该组织中酸类化合物含量较低的原因。 3.3 过滤及差速离心获得细胞器粗提物 ( 1 ) 匀浆液必须经过 4 层纱布在漏斗上过滤到烧杯或锥形瓶中，残留在纱布中的匀浆液可以直接拧到滤液中。过滤必须在 4~10°C 条件下进行。 ( 2 ) 将滤液转移到预冷的离心管中（体积依滤液的多少而定，可以是 50 ml、250 ml 甚至 500 ml) ，然后在 1500 g 下用固定转角的转头离心 5 min。转头需预冷至 4°C。 ( 3 ) 所得沉淀为淀粉粒、核及细胞碎片。将上清液小心转移至新的离心管中，然后 18000 g 离心 15 min。高速离心所得粽褐色或黄色或绿色沉淀即为含有各种细胞器的粗提物。 ( 4 ) 用 5~10 ml 标准清洗液 [ 如 0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES-KOH、pH 7.2 和 0.1% ( m/V ) BSA ] 将细胞器粗提物重新悬浮。如果匀浆缓冲液中所用渗透介质为蔗糖，则 0.3 mol/L 甘露醇应改为 0.3 mol/L 蔗糖。 ( 5 ) 将重新悬浮的液体转移至 50 ml 的离心管中，用清洗液调整体积至 40 ml 后 1000 g 下离心 5 min。 ( 6 ) 上清液转移至新的离心管中，18000 g 离心 15 min。去掉上清液，沉淀用小量体积的清洗液重新悬浮均匀（见注释 6)。 3.4 密度梯度离心纯化线粒体 经上述步骤所得的线粒体可以用来进行呼吸效率的测定。但是根据其组织来源的不同，所得的线粒体常常混有类囊体或淀粉体膜、过氧化物酶体、乙二酸循环体、内质网及细菌，需要经过 Percoll 密度梯度离心进一步纯化。 ( 1 ) 将清洗过的线粒体溶液注入到 Percoll 梯度的表面，一般从 80 g 黄化植物组织或 40 g 绿色植物组织中提取的线粒体用 35 ml Percoll 梯度溶液，使用 50 ml 的离心管进行离心（见注释 2) 。 ( 2 ) 35000 g 离心 45 min，使用转角转头，降速时不设置「 brake」减速。 ( 3 ) 离心后，线粒体呈浅黄色条带，位于绿色的叶绿体或黄色的质体膜条带之下 ( 图 7-2)。用巴斯德吸管将线粒体部分吸出后（避免吸入质体）用 4 倍体积的标准清洗液稀释，然后 18000 g 离心 15 min。  ( 4 ) 所得松软沉淀可再次用清洗液悬浮，并在同样速度下离心 15 min。最后所得线粒体沉淀可按 5~20 mg 线粒体蛋白/ml 清洗液（可用 Bradford 或 Lowry 法定量）重新悬浮溶解。 3.5 纯度鉴定 可以通过各种细胞器标志性酶的活性来确定线粒体的污染程度。过氧化物酶体可以鉴定过氧化氢酶、羟基丙酮酸还原酶或者乙二醇氧化酶的活性；叶绿体可以用叶绿素含量，白色体可以用类胡萝卜素的含量或碱性焦磷酸酶的活性；乙二醛循环体可以用异柠檬酸裂解酶的活性；内质网可以用对抗霉素 A 不敏感的细胞色素 C 还原酶；质膜可以用 K+/ATPase 活性等来确定各种细胞器对线粒体的污染程度。经过仔细地密度梯度离心后，一般来自胞质的污染比较少，即使有污染，也可以通过测定乙醇脱氢酶的活性来确定。有关各种标志酶活性的测定方法可以参考文献 [ 1 ] 和文献 [7]。其他线粒体纯度相关事项可以参考注释 7。 3.6 线粒体完整性鉴定 分离出的线粒体可以通过各种方法来确定其结构的完整性。外膜的完整性通过其对外源细胞色素 C 的不通透性来确定。施加非离子变性剂（0.05% m/V Triton X-100 ) 前后细胞色素 C 氧化酶活性的比值可以用来衡量线粒体的破裂比例。以下介绍两种经典且简单易行的酶活测定方法。 1. 氧气消耗速率 在一个细胞色素 C 可再生系统（保证稳定的底物浓度）中，使用氧电极即可测得氧气的消耗速率。 ( 1 ) 在 20 mmol/L 抗坏血酸中先测定氧气的消耗速率，然后在 25 μmol/L 细胞色素 C 中测定氧气的消耗速率，接着加入 Triton X-100 ( 0.05% ) 后测定氧气消耗速率，最后加入 1 mmol/L KCN 停止反应。 ( 2 ) 细胞色素 C 氧化酶活性定义为在细胞色素 C 和 Triton 存在条件下氧气的消耗速率减去加入 KCN 后的消耗速率（加入 KCN 后的氧气消耗速率通常和仅有抗坏血酸条件下测定的氧气消耗速率相同）。 ( 3 ) 没加 Triton 前所得的酶活与加入 Triton 后所得的酶活的比值即可衡量线粒体破裂的比例。 2. 还原型细胞色素 C 的氧化 用分光光度计测量反应体系在 550 nm 下吸光值的变化可以测定还原型细胞色素 C 的氧化程度。 ( 1 ) 将线粒体蛋白加入到反应体系中（0.1 mol/L Tris-HCl、25 μmol/L 还原型细胞色素 C) ，在 550 nm 下测定吸光值的变化速率，然后加入 0.05% Triton X-100 继续测定吸光值的变化速率。最后加入 1 mmol/L KCN 停止反应。 ( 2 ) 细胞色素 C 氧化酶的活性定义为在加入 KCN 之前的速率减去加入 KCN 之后的速率。 ( 3 ) 同样没加 Triton 前所得的酶活与加入 Triton 后所得的酶活的比值即可衡量线粒体破裂的比例。 3.7 线粒体的贮存 制备的线粒体可以在冰上保存 5~6 h 后仍然保持膜的完整性和呼吸活性。长期保存可以在加入 DMSO ( 终浓度或乙二醇（7.5% V/V ) 后用液氮迅速冷冻保存于 -80°C 数月。 3.8 线粒体各组分的分级分离 采用渗透胁迫加差速离心的方法可以将植物线粒体分级分离为 4 个组分：线粒体基质（MA)、膜间隙（IMS )、内膜（IM ) 及外膜（OM) 。 ( 1 ) 开始分级分离前，将线粒体样品盐洗一遍以去除一些非特异性结合在线粒体外膜的蛋白质：将 5~10 mg 线粒体沉淀悬浮在 4 ml 清洗液（不含 BSA ) 中，加入 2 mol/L KCl 至终浓度为 200 mmol/L。分装在 2 个 2 ml 的离心管中，20000 g、4°C 离心 15 min。 ( 2 ) 小心去掉上清液。用低渗缓冲溶液重新悬浮沉淀，并定量至 6 ml 后转移到 10 ml 的锥形瓶中，冰浴上搅拌 15 min ( 见注释 8) 。这一步操作使得线粒体膨胀，导致外膜破裂。也可以外加一定的机械剪切力（如用微量玻璃匀浆器）来增加对外膜的破碎。 ( 3 ) 向处理过的样品中添加 0.9 ml 2 mol/L 的蔗糖（约为 1/8 倍稀释蔗糖）后分装到 2 ml 的离心管中，20000 g，4°C 离心 15 min。 ( 4 ) 小心收取上清液（包含外膜小泡和膜间隙蛋白）冻存于 -80°C。 ( 5 ) 去掉残存的上清液，然后将沉淀（mitopksts) 重新悬浮在 2 ml 250 mmol/L 的 KCl 溶液中，20000 g，4°C 离心 15 min。 ( 6 ) 去除所有上清液，沉淀用 0.5~1 ml 双蒸水溶解后在微量匀浆器中研磨约 5 min 以破碎沉淀。 ( 7 ) 匀浆液定容至 4 ml 后分装至 2 个 2 ml 的离心管中 20000 g，4°C 离心 15 min。 ( 8 ) 小心收取上清液（包含基质蛋白），于 -80°C 冻存。 ( 9 ) 沉淀部分包括线粒体内膜和未破碎的沉淀。将沉淀溶于 4 ml 双蒸水中，液氮下反复冻融 2 次或 3 次。20000 g、4°C 离心 15 min。收取沉淀即为内膜部分。也可以用 100 mmol/L Na2CO3 清洗内膜部分以富集膜内在蛋白。 ( 10 ) 分离外膜以及膜间隙蛋白组分，以及从基质（MA) 中去除污染的膜成分需要使用超速离心。将贮存在 -80°C 的基质以及外膜与膜间隙组分在 4°C 融解后 100000 g 4℃ 离心 1 h。对于外膜与膜间隙组分，上清液即为膜间隙蛋白质，沉淀即为外膜部分；对于基质组分，上清液即为纯的基质蛋白质溶液。各部分可以重新冷冻保存。 （11 ) 样品纯度通过测定各组分的标志性酶活性即可判定。内膜：细胞色素氧化酶（COX)；基质：延胡索酸酶；膜间隙：肌激酶；外膜：抗生素 A 不敏感的 NADH 细胞色素 C 氧化还原酶 。也可以用抗体识别各标志性酶的反应来确定各组分的纯度。各组分蛋白质在 SDS-PAGE 胶上显示出不同的条带分布特征（图 7-3)。  |
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