实验材料
| 试剂、试剂盒 | |
|---|---|
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、转基因插入位点的数目 第一代（ T0）转基因植株外源基因的插入位点数目，一般都是通过遗传方法进行鉴定。虽然遗传分析可以在任何世代进行，但是一般选择转基因植株自交，或与野生型测交后得到的第二代（T1 ) 进行 。对代转基因植株，统计目的基因表达与不表达的个体，可以获得表型的分离比； 而对 T1 代转基因植株，统计含与不含目的基因的个体，则可以得到群体基因型的分离比。在估测转基因插入数目时，经常会采用前一种方法。但是，通过表型鉴定获得的结果，经常会低于实际情况； 通过基因型鉴定所获得的结果，则可以准确判定转基因的插入数目。对 T0 代及其子代分析结果的比较，同样也可以提供转基因插入位点数的信息。最近几年，精确评估转基因插入数目，对发展 “基因清除”技术起了重要作用，这一技术主要是通过多个 T-DNA 区共转化，获得不含任何选择性标记基因的转基因植株。转基因植株中外源基因的插入位点数与外源基因的拷贝数并非完全一致的，因为在同一插入位点有可能会含有多个拷贝，也有可能是以单拷贝的形式插入多个不同的位点。 1. 转基因表型的分离 T0 代转基因植株自交或杂交可以获得 T1 代，用代植株可以评价外源基因的表达情况。转入植物基因组的任何外源基因都可以用乃代植株的表型来分析，筛选 T。代转基因植株的选择性标记基因，也常应用于鉴定 T1 代转基因植株外源基因的表达。若目标基因的表型容易观测的话，同样也可以用于几代转基因植株的表型分析，如通过碘染试验可以方便地观测与植物淀粉合成相关基因的表型。卡那霉素和潮霉素等抗生素，也可以分别用于鉴定转基因后代中含有卡那霉素基因和潮霉素基因等相关抗性基因的阳性植株（见注 1) 。另外，通过将草丁膦、磺酰脲或草甘膦等除草剂喷洒幼苗或涂叶，也可以快速地鉴定出含有 BAR、ALS 或 EPSP 等功能基因的转基因植株。而 β-葡萄糖醛酸酶基因、LUC 和绿色荧光蛋白基因等报告基因通常用于检测乃代植株的外源基因表达。无损伤表型鉴定，如观测绿色荧光蛋白基因或 LUC 的表达，优于有损伤表型鉴定，如葡萄糖醛酸酶基因染色或抗性检测，因为前者可用于外源基因未表达的代植株的后续分子检测。 在事件 1 和事件 2 中，凡代转基因植株由 T。代植株自交获得，其 β-葡萄糖醛酸酶基因活性主要通过胚乳、叶片和根的组织化学染色方法测定。 ( 1 ) 胚乳染色时，种子先用 70% 的乙醇杀菌 30s，然后用 50% 的饱和次氯酸钠溶液浸洗 15 min，再用无菌去离子水洗三次，第三次漂洗后浸数小时。在超净工作台上用灭过菌的解剖刀将处理好的种子切成两半，含胚的一半种子在 MS 培养基上获得乃代幼苗，另外一半则用来 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 染色。经常人们会将胚乳和胚的表型放在一起进行比较，因为它们的基因型虽然相同，但是基因组倍性不同。 ( 2 ) 对于根和叶的染色，则没有必要对种子进行消毒；当然种子也可以先在 70% 的乙醇中洗 30s，然后用无菌的去离子水洗三次。对于一些物种，如小麦和大麦，先将种子置于湿润的滤纸上 5℃ 暗培养 2~ 4 天，接着在 20~25℃ 的暗环境下萌发 5 天，然后在同样温度下每天 16 h 光照培养，5~7 天后收集根和叶片。这一方法优于胚乳染色，因为有些物种的种子（如小麦和大麦）对次氯酸钠非常敏感。 ( 3 ) 根据样品的体积大小，分别将它们浸没在加有 β-葡萄糖醛酸酶反应液的 96 孔、24 孔或 6 孔板上。 ( 4 ) 样品放在打开的平板上抽真空（71 mm 莱柱）10~15 min，37℃ 摇床上反应过夜。 ( 5 ) 第二天，观察 β-葡萄糖醛酸酶染色后的样品。图 13. 1 是事例 2 中 T1 代转基因种子胚乳染色完成后所得的结果。  ( 6 ) 转基因插入位点的估测：根据 T1 代转基因植株 β-葡萄糖醛酸酶活性的观测结果可以得出一个分离比。根据观测值与单基因孟德尔遗传理论值（表 13. 1 ) 的卡方分析结果，可以判定单个基因的插入位点数（表 13.2)。在事例 2 中，几代转基因植株中，83 个单株具有 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 活性，而 17 个单株没有（ 图 13.1 ），这一结果表明转基因插入位点应该是一个。尽管许多文献上均采用此种分析方法，但值得注意的是，这一方法得出的结果只是对转基因插入位点的一种估测 （ 见注2)。同样是事例 2 , 进一步的分子检测结果 （见 3.1 节中 “基于基因型的遗传分析”）却表明，事实上该次外源基因的独立的插入位点应该是 2 个，而不是 1 个 ，因此根据表型得出的结果是不准确的。所以，真正的遗传鉴定应该是基于对转基因后代基因型而并非是表型的调查结果分析所获得的。   2. 基于基因型的遗传分析 表 13. 1 和表 13. 3 分别列出了 1 个或 2 个基因插入到 1 个、2 个、3 个或 4 个位点时，自交一代后的子代分离群体中，按照孟德尔遗传规律分离的理论比值。乃代植株为研究对象，采用的分析方法为 PCR 检测或者点杂交等分子检测方法。由于采用分子手段对几代植株的基因型鉴定比表型鉴定更为昂贵和费工（见 3 .1 节 “转基因表型的分离”），因此，基于基因型的遗传分析方法一般很少采用，尽管基于表型的分析方法有种种局限 （见注2) 。当然，可能的情况下最好将两种方法结合在一起进行分析。下面我们将结合事例2 ，介绍此种分析方法的具体操作流程：  ( 1 ) 转基因植株的培育和表型鉴定分离结果的统计按照3. 1 节中转基因表型的分离中步骤 2~5 进行。保证结果准确性的重要一步是，乃代植株不要选择以使所有植株存活，并可以用于后续的实验分析。因为抗生素或除草剂的筛选会杀死转基因沉默的个体，从而导致遗传分析的结果发生偏差（见注 2 ) 。在事例2 中，具有明显 β-葡萄糖醛酸酶活性的 83 粒 T1 代种子（图 13. 1) 应该是含有 β-葡萄糖醛酸酶基因的，因此无需进行进一步的分析。而 17 个不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的几代植株则应该利用分子检测手段作进一步的鉴定，以明确它们是因为 β-葡萄糖醛酸酶基因的沉默，还是确实不含有 β-葡萄糖醛酸酶基因而没有表现出 β-葡萄糖醛酸酶活性。 ( 2 ) 收集 17 个不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的代植株的叶片样品，以及阴性对照（野生型植株）和经 PCR 检测的阳性对照样品，样品的长度应该与 1.5 ml 的微型离心管匹配。 ( 3 ) 按照产品的使用说明用 DNA 提取试剂盒抽取叶片样品的基因组 DNA。 ( 4 ) PCR 反应中应加入的 DNA 模板量根据各物种的基因组大小而定，25 μl PCR 反应体系中水稻基因组 DNA 的加入量通常为 25 ng，而大麦或者小麦则为 100~150 ng。 ( 5 ) 每个 PCR 反应体系包括植物基因组 DNA，1x 的反应缓冲液（含 2.5 mmol/L MgCl2) ，250 μmol/L dNTP，正、反引物各 0.4 μmol/L ( 如根据 β-葡萄糖醛酸酶基因设计），2 U Taq DNA 聚合酶。 ( 6 ) PCR 的反应程序：DNA 样品先 95°C 变性 1 min；接着是 95℃ 变性 30s、60°C 退火 30s、72°C 延伸 1 min，共 30 个循环；循环结束后，72℃ 最后延伸 10 min。 ( 7 ) PCR 反应产物（5~10 μl）用 1%~1.2% (m/V) 含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶进行电泳分析（每 100 ml 凝胶加入 5 μl 溴化乙锭，琼脂糖凝胶用 0.5X TBE 缓冲液加热溶解），电泳时电压为 80~100 V，时间约为 20 min。紫外灯下观察（图 13. 2) 到 17 个代检测样品中有 7 个单株含有葡萄糖醛酸酶基因却没有 β-葡萄糖醛酸酶活性（ 即 β-葡萄糖醛酸酶基因被沉默了）。 ( 8 ) 可以利用植物本体单拷贝看家基因或者 RFLP 探针的引物重复步骤 5~7 对 DNA 样品进行质量鉴定，以确保它们能够成功地进行 PCR 扩增。通过对看家基因的扩增分析，结果表明从事例 2 中获得的 10 个样品可以进行 PCR 扩增（图 13. 2) 。 ( 9 ) 计算转基因插入位点数：利用孟德尔遗传规律的理论值（表 13. 1 ) 可以对所获得的观察值进行卡方检测。事例 2 中，90 个 T1 代单株含有 β-葡萄糖醛酸酶基因，而 10 个单株不含，根据卡方检测结果我们可以看出植物基因组中转基因的插入位点应该是两个，它们可以独立地自由分离（表 13.2) 。 3. 跨世代 Southern 分析 Southern 分析一般用于鉴定各个转基因插入位点的排列形式（见 3 .2 节中“ Southern分析” ）。当然，通过对不同世代转基因植株杂交检测结果的比较，它也可以用于转基因插入位点数的测定。例如，根 据 T。代和自交所得到凡代植株的 Southern 分析结果就可以判定外源基因的插入位点数。以事例 2 为例，下面具体介绍这种方法。  ( 1 ) 样品的 DNA 可以按照 DNA 提取试剂盒推荐的方法从植株叶片中抽提（见注3 ) ，DNA 的浓度根据所提样品在波长为 260 nm 的吸光值推算。样品提好后可以放在 4℃ 短时保存，也可以长期存储在 -20℃ 中（见注4 ) 。 ( 2 ) 用于 Southern 分析的 DNA 量主要根据每个作物基因组的大小而定，一般水稻为 5 μg，大麦和小麦则需要 20 μg。DNA 样品消化时，反应体积为 50~80 μl，限制性内切核酸酶的用量为 10~15 U/μg DNA ( 见注5 ) 。另外，进行样品 DNA 消化时应同时消化阴性对照（即野生型）和阳性对照（如已经过 Southern 分析鉴定为阳性的单株）的 DNA。 ( 3 ) 酶切消化后的反应液先用真空离心机浓缩到约 30 μl 的体积，然后加入到浓度为 0.8% 的琼脂糖凝胶中（用 1x 的 TBE 熔化），在 40 V 的电压下电泳过夜。同时凝胶中还应该加入1 或 2 种标记 （如 600 ng 的用 Pst I 或者 HindⅢ 酶切后的 λ 噬菌体 DNA 产物）。另外，在空白点样孔上还应加入限制酶的反应缓冲液以避免电泳时有可能发生的带偏差。 ( 4 ) 电泳完毕后，用溴化乙锭染好的凝胶在紫外灯下拍下照片，以便于确定 DNA 的酶切消化程度和各个样品点样时的均一度，同时记录标记的各个条带在凝胶中的位置。 ( 5 ) 凝胶先用 0.25 mol/L HCl 溶液（缓慢摇动）洗 15 min 后再用水冲洗，然后在 0.4 mol/L NaOH 溶液中变性 15 min 后，将 DNA 样品过夜印迹到尼龙膜上。转印完成后 ，将尼龙膜放入 2X SSC 溶液中洗 2 min，再用薄膜包好放在 5℃ 下短期保存或者 -20℃ 下长期保存。 ( 6 ) 尼龙膜在 65°C 下先放入杂交液中预杂交 2~5 h , 杂交时要保持缓慢的摇动。50 ml 杂交液中含有 2 ml 5x HSB、1 ml Denhardt 反应液 II 和 1 ml 载体 DNA ( 在沸水中变性 7 min)。 ( 7 ) 杂交使用的探针（长度大约为 500 bp) 可以通过对转化用质粒进行酶切凝胶回收（用 QIAquick Gel Extraction kit 试剂盒）后获得，也可以通过 PCR 扩增后再用 PCR 回收试剂盒（ 即 QIAquickPCR Purification kit) 回收后获得，具体操作根据产品的使用说明。25 ng ( 体积 15 μl) 的探针沸水浴 7 min 后在冰上放置 5 min，然后加入 5 μl OLB、2 μl BSA、2 μl DNA Polymerase I Klenow 片段（5 U/μl) 和 2 μl 32P dCTP 在 37℃ 下反应 2 h 以完成探针的标记。标记好的探针用 2.6 μl 3 mol/L NaOH 变性 5 min，然后加入到预杂交液中。杂交膜在预杂交液中 65℃ 缓慢振荡过夜。 ( 8 ) 尼龙膜先用 500 ml 2x SSC 和 1% SDS 溶液洗两次，每次 15 min，然后再用 500 ml 0.2 X SSC 和 1% SDS 溶液洗两次，每次也是 15 min。洗好后，尼龙膜用薄膜包好。 ( 9 ) 估测转基因插入的位点数：处理好的尼龙膜可以用胶片放射自显影分析或者磷屏分析。例如，在事例 2 中通过比较 T0和 T1 代植株的 Southern 分析结果可以得出转基因插入位点为两个（图 13.3 ) 。 尽管 Southern 分析方法可以精确地鉴定出转基因插入位点的数目，但是也有其局限性，具体请见注6 。此外，这种分析方法也可以用来检测后代中转基因位点结构的稳定性。当多个 DNA 片段或者载体一起转化时，Southern 分析也应该用可以公用的单个探针或者多个特异性的探针混合在一起进行杂交（即每个片段或载体一个探针）。  二、每个转基因插入位点的构型 当只有一个外源基因插入位点时，通过对 T。代植株的分子鉴定即可以了解插入位点外源基因的拷贝数和排列方式。当发现转基因植株中有多个插入位点时（ 根据 3.1节中的方法鉴定），则要对每个插入位点逐个进行分析，其主要是采用分析分离群体的单株，或者分析各个位点的纯合系的方法。 1. Southern 分析 在鉴定转基因插入位点的构型时，Southern 分析是最常用的方法。通过酶切和能覆盖用于转化的全长 DNA 序列 （包括载体的骨架序列）的探针的联合分析，可以重构出每个插入位点的全部结构。首先要做的是估测每个插入位点的外源基因拷贝数（保持原样或者重排）。根据插入位点的复杂性采用不同的方法进行分析。下面分别介绍含有一个或少数几个的拷贝数的简单转基因插入位点，以及含有大量拷贝数的复杂转基因插入位点的具体分析方法。 ( 1 ) DNA 的提取、膜的制备和杂交具体可以参考 3.1 节步骤 1~ 8。植物基因组 DNA —般采用单酶切，本例中用的是质粒中的 Xbal 酶切位点。使用的探针必须可以与酶切位点 5 ' ( 以潮霉素基因为例）或者 3 ' ( 以 β-葡萄糖醛酸酶基因为例）端的外源基因序列特异性杂交（见注 8) 。 ( 2 ) 用放射自显影仪或者感光成像仪对膜进行初步分析，根据所得的结果一般就可以对每个插入位点的复杂性进行初步的评估。 ① 简单插入位点的分析 经过酶切和探针杂交后，Southern 分析所得结果产生最多 4 条亮度相近的杂交条带 ( 如事例 2 位点 1 和位点2) 。 a. 用于 Southern 分析（3.1 节步骤 1~8 ) 的限制性内切核酸酶（ 见注 9 ) 和探针可以参照表13. 4 的常用方法。通过 Southern 分析不仅可以对转基因位点区域内的序列进行研究，也可以对两边近邻序列进行分析。如果需要更为精确的结果，推荐最好还是用多种不同的酶和探针进行多次分析。例如，在事例 2 的位点1 中 （ 图 13.4)，应该再用 Hind Ⅲ 作为限制性内切核酸酶酶切，该酶切位点位于 β- 葡萄糖醛酸酶基因表达区的侧边，用 β- 葡萄糖醛酸酶基因启动子或终止子的序列作为探针进行杂交分析，因为在该插入位点上可能存在多拷贝和重排的外源基因。另外，利用与载体抗性基因序列特异性结合的探针还可以检测转基因个体中是否含有载体序列。   b. 事例 2 位点 1 的结构鉴定：经过 Xba I 和 HindⅢ 酶切及 β-葡萄糖醛酸酶基因探针杂交后，膜上出现的多个条带说明该插入位点可能含有多拷贝的 β-葡萄糖醛酸酶基因，一个完整和一个可能缺失的。但是，潮霉素基因和 NPTI 基因探针的杂交条带却只有一条，这个结果表明载体序列已经转染和整合到了植物基因组上。这主要是因为 T-DNA 的左边界的无效识别/剪切，导致对 T-DNA 序列的 “通读”引起的（见注 10)。根据杂交条带的大小，则可以推测出插入位点序列形成的结构（图 13.4)。 c. 事例 2 位点 2 的结构鉴定：用 β- 葡萄糖醛酸酶基因和潮霉素基因的探针进行杂交时只有一条带。用的探针杂交时没有信号，表明载体主骨架没有整合到植物基因组上。根据杂交条带的大小可以推测出该位点序列所形成的结构（图 13.5)。 ② 复杂插入位点的分析 通过多种不同的限制性内切核酸酶和探针对事例 1 进行 Southern 分析，发现杂交结果中有 4 条或以上信号强度不同的杂交带（图 13. 6) 。对于这种情况，杂交结果一般不太可靠 [ 17 ] , 单独的结果也不能用来精确地推测插入位点的构型和外源基因的拷贝数 ( 见注 11)。但是通过对杂交信号的光密度分析，还是可以估测转基因以及外源基因完整的表达单位（即启动子+基因+终止子）的拷贝数。用转基因载体上所没有的酶切位点进行 Southern 分析时，通过所得的结果也可以帮助了解插入位点处植物基因组序列的存在情况。  ( a ) DNA 的提取可以参考3. 1 节步骤 1。必须先精确测定野生型植物基因组 DNA 浓度和作为标样的质粒 DNA 浓度，以便于后续的光密度分析（见注 12)。 ( b ) DNA 的消化可以参考3.1 步骤 2 。与 1 、 2 、5 、10、 20 、40 和 80 拷贝外源基因相当的标样分别加入 5 μg 野生型 DNA 中 （ 见注 13 ) , 另外推荐在每张膜上加入阳性对照 （ 见注 14)。 ( c ) Southern 分析主要参考3. 1 节步骤 3~8，利用 β- 葡萄糖醛酸酶基因表达区相邻的 Hind Ⅲ 酶切位点，或者是 Pac I 、Nhe I 、Bst X I 、Apa I 和 Kpn I 等转化载体上无酶切位点的酶，降解植物基因组 DNA。分析时需要4 种不同的探针：1 个单拷贝的 RFLP 探针；3 个分别可以与 β- 葡萄糖醛酸酶基因、潮霉素基因和 NPTI 基因特异性结合的探针。RFLP 探针是为了保证各个样品所加样量的均一性（见注 14)。经过 Hind Ⅲ 酶切后的杂交，一 些条带的大小和质粒 DNA 酶切产生的（CfAS) 的表达区（2.9 kb) 相似，而其他的更大或小一些的条带可能是由 DNA 重排所致。利用 Spe I 和 HPT 基因探针的 Southern 分析的结果与上面类似（ 图 13.6) 。而利用载体无酶切位点的 Apa l 进行酶切时，β- 葡萄糖醛酸酶基因探针杂交出了两条带，由此表明该插入位点内可能还含有部分植物基因组序列。事例 1 中存在着大量拷贝的 NPT I 基因，也证实了载体序列的整入( 因为基因枪法使用的是完整的载体质粒）。然而根据这些信息仍然无法得出事例 1 中转基因插入位点的构型。  ( d ) 事例 1 中转基因拷贝数的鉴定：杂交膜上除去背景后所有杂交信号的强度都可以用光密度计（Bio-Rad 690 ) 或感光成像仪等仪器进行定量分析。根据信号的强度和基因拷贝数的相关性，通过回归分析可以重建标准曲线。依照标准曲线和酶-探针联合分析的结果，则可以推测出每个样品外源基因的拷贝数（ 见注 15 ) 。Hind Ⅲ、Spe l 和 Xba I 酶切后杂交的信号表明转基因事例 1 中含有 36 个拷贝的 β- 葡萄糖醛酸酶基因和 14 个拷贝的潮霉素基因（图 13. 6 ) 。 2. 其他方法 通过 Southern 杂交分析，对每个转基因插入位点的总体结构有了一个大致的了解。但是要想完全掌握转基因插入位点的所有信息，则需要对插入区和近邻的基因组序列进行测序分析 [18, 19 ] ，有时对基因组 DNA 的序列分析更为重要。本章中，对此方法不做详细介绍，但是，拟南芥 [ 20 , 2 1 ] 和 水 稻 [ 22 ] 等模式植物的转基因近邻序列高通量分析方法已见诸报道。根据插入区近邻植物基因组序列的测序结果，可以设计 PCR 引物，逐步地对整个插入区进行扩增和测序。此外，依照近邻序列所设计的引物，还可以用于野生型基因组序列的扩增分析，从而可以鉴定出外源基因插入位点处是否存在基因组序列的丢失。同时，DNA 测序还能鉴定出转基因时是否发生了叶绿体 DNA 和外源基因的共整合。 |
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