下面的操作方法可以使约3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合,对某些蛋白来说,生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。
1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中,并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液(如Tris或者甘氨酸),可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算:蛋白质量(mg)/蛋白分子量(MW)=蛋白质的毫摩尔数。
2. 在打开之前,平衡生物素至室温。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超纯水中,加入足够量浓度的生物素,一般对于10 mg/ml 蛋白来说超过12倍分子数,对于2 mg/ml 蛋白溶液应超过20倍,或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中
3. 室温30分钟,或冰上放置2小时。
4. 用30 ml PBS预洗纯化柱,上样,加入与欲收集量相同的缓冲液,收集0.5 ml 或1 ml 于单独的管中。
5. 以280 nm 的吸收值测定蛋白含量。
6. 生物素化的蛋白4℃存放至使用,可加入叠氮钠、甘油等保存。
HABA法检测生物素标记效果
试剂配制:
1. PBS(100 mM 磷酸盐,150 mM Nacl pH7.2)
2. HABA/亲和素溶液:10 mg 亲和素、600 ul10 mM HABA于19.4 ml 的PBS中,该溶液的A500大约在0.9~1.3之间,溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成(HABA溶液)可过滤后使用。
比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比:
1. 吸取900 ul HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。
2. 测定该溶液在500 nm 处的吸收值并记录为“A500 HABA/Avidin”。
3. 吸取100 ul 生物素标记的蛋白于杯中并测定500 nm 的吸光度值,记为A500 HABA/Avidin/Biotin (数值必须恒定15s 以上)如果A500 HABA/Avidin/Biotin的值不超过(≤)0.3,重新稀释待测样品并检测。
注:计算结果时必须考虑稀释度。
4. 计算Biotin/Protein摩尔比
①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度=蛋白浓度(mg/ml)/蛋白的分子量
②B=500nm处的吸光度变化
△A500=(0.9×A500HABA/Avidin)-A500HABA/Avidin/Biotin
③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/(34,000×光程)
④Biotin/Protein摩尔比=C•10•稀释倍数/
我所发展可实现靶蛋白结构稳定性分析的时间分辨紫外激光解离质谱法发布时间:2024-04-08 | 供稿部门:1822组 | ......
阿尔茨海默病(AD)又称老年痴呆,起病隐匿,病程缓慢且不可逆,以智能障碍为主。随着人口老龄化的进展,全球AD患者数量逐年增加,严重危害中老年人的健康,也给家庭和社会带来沉重的负担。回望2023年,AD......
——天津市标准物质与稳定同位素标记技术研究重点实验室扩建剪彩及标准物质技术研讨会成功举办2024年1月16日,天津市标准物质与稳定同位素标记技术研究重点实验室(以下简称重点实验室)扩建剪彩及标准物质技......
叶绿体是植物进行光合作用的细胞器。正常发育过程受到核基因组和叶绿体基因组在多个层次的协同调控。核质互作的分子机理是叶绿体生物发生的核心科学问题之一。光合膜蛋白复合体的反应中心亚基通常由叶绿体基因编码,......
复旦大学超高分辨率蛋白生物药质谱分析系统采购国际招标招标项目的潜在投标人应在通过复旦大学采购与招标管理系统(以下简称电子采购平台,网址为:https://czzx.fudan.edu.cn)在线获取招......
控制KRAS:揭示关键癌症蛋白的变构位点研究人员在基因组调控中心和威康萨克研究所利用深度突变扫描技术全面识别了蛋白质KRAS中的变构控制位点,该蛋白质是许多类型的癌症中最常见的突变基因之一。科学家们使......
神经退行性疾病,如帕金森病或阿尔茨海默病,与大脑中蛋白质聚集的沉积有关。当细胞废物清除系统存在缺陷或超负荷时,这些聚集物会积累。一种主要与免疫系统信号传导过程相关的蛋白质NEMO可以防止帕金森病中发生......
——第三届尿液生物标志物学术研讨会(Urimarker2023)顺利召开11月4日-11月5日,第三届尿液生物标志物学术研讨会(Urimarker2023)于北京师范大学圆满落幕。本次研讨会采用线上线......
想象一下,科学家们用手电筒探索一个黑暗的房间,却只能清楚地辨认出光束范围内的东西。说到微生物群落,他们历来无法看到光束之外的东西---更糟糕的是,他们甚至不知道这个房间有多大。在一项新的研究中,来自美......
几十年来,科学家们已经知道,“垃圾DNA(junkDNA)”实际上起着至关重要的作用:尽管基因组中的蛋白编码基因提供了构建蛋白的蓝图,但是基因组中的一些非编码部分,包括以前被认为是“垃圾DNA”的基因......