流感病毒实验室检查技术

一、标本的采集与处理

（一）标本的采集

1、病毒分离标本的采集

病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，及其保存、运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。

标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hank‘s、Eagle’s或水解乳蛋白液。为防止细菌和真菌生长，在采样液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为每毫升采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。主要的采集方法有以下几种：

1）鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。

2）咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。

3）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器（国外有售）从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。由于该收集器国内难买到，也可采用国内一种设计装置（见郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其实验技术。中国三峡出版社P186，1997）。

4）鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程数次。洗两侧鼻孔最多可用10-15 ml洗液。

5）漱口液：用10 ml洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发“噢声”，让洗液在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液。

注：取鼻洗液和漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有则洗液和含漱液中不应含有抗菌素。

2、血清标本采集

血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，最迟不超过发病后7天。恢复期血样应在发病后2-4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。血清可在4℃存放一周，长期保存置-20℃。

（二）标本运送

标本应在低温下，24小时内运送至实验室。标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。     血清标本可在4℃存放一周，长期保存置-20℃或以下。

（三）标本处理

标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液，用手将装标本的管充分振荡，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。

鼻咽漱液或抽取液：用无菌毛细吸管，在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同样置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。

注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同前，混匀后置4℃ 1-2h后方可接种。

二、病毒分离

病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一。多用鸡胚来分离流感病毒。近来随着分子生物学技术的发展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本的有所不同，而通过MDCK细胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似。

另外由于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此在病毒分离时同时采用鸡胚和MDCK细胞两套系统。

流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，故近来在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。然而，该两种细胞无细胞核，沉积慢，一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果，同时在“U”型孔板中，很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空洞。

（一） MDCK细胞分离

1、实验材料

MDCK细胞

Eagle氏培养液

Hank‘s溶液

0.25%胰酶和Versene消化液

双抗（青、链霉素）或庆大霉素和抗真菌素

胎牛或小牛血清

5.6%或7.5%的NaHCO3

细胞培养液配制

每500 ml Eagle’s 液加： 终浓度

双抗 5 ml 100U/ml青霉素

100ug/ml链霉素

胎牛或小牛血清 0.1-0.15ml/ml

使用前用NaHCO3 将pH调至7.4-7.6。

细胞维持液配制

同培养液，但不含胎牛或小牛血清，而含终浓度为2-3 ug/ ml 胰酶，用前用NaHCO3 将pH调至7.6-7.7。

注：目前市场上出售已配好的Eagle‘s试剂有两种：一种已含有谷氨酰胺，另一种不含。如不含，配工作液时需补加。

2、病毒接种和收获

1） 在低倍光学显微镜下检查MDCK细胞生长状态。

2） 成片的细胞弃生长液，用Hank’s液洗两遍，将残余的牛血清洗净，因牛血清中含有流感病毒非特异性抑制素，会影响流感病毒的复制。

3） 每瓶加入接种标本0.5-1.0 ml，轻摇细胞瓶，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附1-2h。

4） 倒掉感染液，再用Hank‘s液洗1-2遍，每瓶加入3 ml维持液，置35℃培养。

5） 次日起每天检查有无细胞病变（CPE）。CPE特征为：细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或碎裂，严重时细胞部分或全部脱落。

6） 收获及红细胞凝集活性（HA）检查

当CPE出现+++ ~ ++++号时进行收获，收获之前也可将细胞冻融1-2次来提高收获标本的病毒滴度。由于无法证实CPE就是流感病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集活性（HA）。用毛细吸管取维持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞，轻摇混之，置室温或4℃，1h后观察结果。出现红细胞凝集的为阳性标本，收获所有维持液进行病毒鉴定，也可暂冰存之。有时将收获的维持液，离心弃沉渣，上清中加适量无菌甘油或明胶或1%牛血清白蛋白冻存之。

由于维持液中无牛血清，同时含一定量的胰酶和NaHCO3，故不应在4℃保存，否则易造成HA活性丢失和pH变高。如有清晰的CPE，但HA阴性应进行盲传。

注：维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中的复制能力。绝大多数流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。细胞培养不像鸡胚，它的维持液中不含有蛋白水解酶，无法将病毒粒非裂解型的HA0 变成裂解型的HA1+HA2。故必须在维持液中加入适量的胰酶。CPE出现时间随感染病毒的型别，甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。一般标本接种后7天还不出CPE，维持液中又查不出HA活性，可认为阴性标本，弃之。

7）传代及盲传

如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞或鸡胚中传代，把HA滴度提高或量增多。如HA可疑，细胞CPE清晰，此时应在MDCK细胞上盲传一代，如仍测不出HA，可认为是阴性。如仍有清晰的CPE并能排除细菌所引起也可认为是非流感病毒。

3、MDCK细胞传代

（1） 把需用的溶液置室温或37℃水浴中预热。

（2） 已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。

（3） 把Versene与0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3 ml（加入量应根据瓶大小不同而异）。

（4） 置37℃恒温箱5-10min，在此期间应在光学显微镜下观察1-2次，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。但千万不可消化时间过长，造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成破碎。

（5） 倒掉消化液，每瓶加入9 ml培养液，用毛细吸管将瓶壁上细胞轻轻吹下吹散。

吸出6 ml接种2小瓶，3 ml/瓶，将原瓶留下，置37℃恒温箱培养。

（7） 一般情况下，1瓶细胞传3瓶，如细胞急用，可一传二。不急用，可一传四等。有时为了控制细胞的代数，可一传八，这样一星期传一代就可以了。一般情况每2-3天需传一代。

4、MDCK细胞保存及复苏

MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，故各实验室应使用液氮冻存代数较低的细胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。

（1）MDCK细胞保存

将单层细胞消化分散成为单细胞；加入0.9 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亚砜；相混收集于保存小管中；缓慢冻存：放4℃2h，转放-20℃2h，再转放液氮中长期保存，也可置-70℃短期保存。

（2）MDCK细胞复苏

细胞冻存管从液氮罐取出后，速放37℃水浴溶化，溶化后加入3 ml培养液，混均后加入细胞培养瓶中，置37℃CO2孵箱培养。

（3）MDCK细胞对流感病毒敏感性测试

前面提到MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏感性。其具体测试方法：选一株对MDCK细胞较敏感的流感病毒株，最好为当前在人群中流行的甲型流感病毒。在同一条件下，用早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCID50测定。

如果测试的TCID50比早代的低2个或以上Lg，表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个Lg，表明可继续使用。