HIV检测：更新版

学习目的：
1、了解CDC最新的HIV检测推荐清单
2、描述HIV的病原学
3、列举并解释不同的HIV筛查试验的方法学
4、列举急性HIV感染患者的常见症状
5、定义NAAT并解释使用的时机
6、确定并解释快速HIV抗体检测的方法学
7、列举尿液HIV检测的优缺点
8、讨论家用HIV检测的优劣
9、解释HIV确认试验结果的含义

   自1985年第一个HIV诊断试剂问世以来，HIV的检测已经变得越来越简便、灵敏、更具操作性以及更少侵入性。不幸的是，全国的数据显示，大部分新的人免疫缺陷病毒（HIV）诊断试剂针对的都是疾病的晚期。在美国，有40%的新近诊断为HIV感染的病人会在一年内发展成艾滋病。

此外，美国大约还有1/4的HIV携带者并不知道他们已经被感染了，以至于错失了能够拯救生命的抗病毒治疗的时机。从公共卫生的角度讲，缺乏对HIV感染的认识是导致上述情况的关键；据估计有半数以上通过性途径感染了HIV的患者就是源于缺乏对HIV的警惕所致。

数据显示只要人们对于HIV感染有着清醒的认识，就会减少很多高危行为，从而降低传播感染的可能性。HIV检测提供了一个减少HIV感染持续传播的机会，并给新病人挽救生命的治疗提供了帮助。

   为了提高人们对HIV感染的认知度，美国CDC在2006年扩大了其HIV测试的推荐范围。新的CDC推荐在医疗卫生机构内鼓励所有成年人自愿进行HIV筛查，取代了传统的仅针对“高危”病人进行筛查的做法。

推荐同样建议取消HIV测试所要求的书面同意书、高危人士的年度复检以及妊娠初期HIV检测阴性的妇女第三个月筛查的做法。本文着重对现有HIV测试的类型、不同类型检测在公共卫生和临床领域中所起到的作用等进行了述评。此外对新的测试模式及策略，特别是快速诊断和核酸扩增试验（NAAT）也进行了回顾。

   HIV病原学及自然史

人们对HIV传播动力学和感染后临床过程理解的增加改变了HIV检测策略。HIV是一种逆转录病毒，含一个包膜和一个病毒核心。病毒的包膜是在病毒萌芽期间取自人细胞膜而成，并携带有Env病毒蛋白。Env含有糖蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。

包膜内的病毒衣壳由数千个另一种病毒蛋白（p24）组成。由于这三种蛋白均具有高抗原决定性，因而被用于许多HIV诊断试剂盒中。衣壳包围着两条HIV单链及RNA，每一条单链RNA都含有病毒的九个基因。

   HIV是人类病原体中最具变异性的一种。在美国，大部病例都是由HIV-1型所致。而HIV-2——相似却不同的病毒，在非洲西部一些地区的艾滋病患者中很常见，但在美国却很罕见。1998年CDC报告美国的HIV-2感染者只有79例。而与此同时，有越来越多的HIV-1变异株得到了确认并被进行了分类。虽然世界上大部分HIV感染者的感染株都是HIV-1M株，但全球HIV的分布却是复杂多变的，不同毒株的流行情况时刻都在变化着。HIV-1 O群主要分布在喀麦隆，在美国并不常见，第一例在美国被报道的HIV-1 O群感染者出现在1996年。

   感染的宿主以及病毒标志物已经被用于诊断，但它们在HIV感染的发展过程中会不停地改变着。在HIV感染的最初几天中，病毒会开始活跃复制，这使得病毒RNA的检测成为可能。不久之后可以检测病毒抗原（蛋白）。

在HIV诊断中检测最多的是衣壳蛋白p24，这一般会在急性感染后的两到三个星期内出现。p24在血清中出现的时间较为短暂，会随着体液和细胞免疫的发展而消失。通常最先出现的抗体是抗衣壳或包膜蛋白IgM抗体，但存在时间较短，随后出现的是IgG抗体。

IgG抗体针对的是核（p24）以及包膜（gp160、120、41）蛋白，跟随其后的是抗HIV病毒酶的抗体。抗不同HIV蛋白的可检测抗体的发展过程被称为HIV血清转移，标志着所谓“窗口期”的结束。HIV急性感染期通常指的是从感染了HIV到血清转换的这一过程。

   紧随HIV急性感染之后的是一段可能长达10年或以上的临床潜伏期。在这段期间，病毒的复制会保持活跃，这将导致免疫系统的持久激活和后续CD4 T细胞计数的进行性降低。病毒和宿主两方面的因素都能决定CD4 T细胞计数减少的速率，最终导致的结果是免疫功能丧失和增加机会性感染的可能性。

   HIV检测技术

HIV检测可以分为筛查或确认试验。标准的检测程序是先做一个筛查试验，如果出现阳性结果则再进行一个确认试验。不论使用什么类型的筛查方法，一份出现了阳性结果的样品都应该采用相同或不同的筛查试验再次进行测试。如果该样品重复检测结果仍为阳性，则应进行确认试验。

包括传统检测（酶联免疫测试）和快速检测在内的筛查试验对血清抗体的检测都具有很高的灵敏度，因而很少会出现假阴性结果。确认试验主要包括有免疫印迹（WB）、间接免疫荧光抗体检测（IFA）和新近推出的通过NAAT检测HIV RNA。所有这些测试方法都具有很高的特异性，这意味着出现假阳性结果的可能性很低。

   筛查技术

酶联免疫（EIA）

酶联免疫（EIA）是最常用的筛查方法。该方法操作简便，适合于大量样品的测试，同时也具有较高的灵敏度和特异性。目前绝大多数的EIA检测试剂都已通过FDA认证，可以用于血清、血浆、末梢血、唾液和尿液样品的筛查。

EIA检测试剂采用包被有HIV抗原的微孔板来检测样品中的HIV抗体。EIA产品已经历经四代（见表1），最新的一代已经改进了检测性能，缩短了无法检测抗体的窗口期。第一、二代EIA试剂的窗口期大约为6-12个星期，检测的均是抗HIV IgG抗体。

第一代EIA试剂采用的是HIV病毒溶解物作为靶抗原，而第二代采用的是代表HIV衣壳和包膜的重组蛋白。目前在美国市场应用最多的用于HIV筛查的仍是第二代EIA试剂。

第三代产品除检测IgG抗体为还能检测IgM抗体。它采用的是“双抗原夹心法”，其中一个抗原包背于固相，另一个抗原与诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化酶等结合。另外，第三代EIA试剂还具有检测特定HIV亚型的能力，比如前两代产品所不能检出的HIV-10群或HIV-2。

   第四代产品除了能够检测IgM或IgG抗体外，还能检出病毒衣壳抗原p24的存在。检测p24抗原可以将窗口期缩短至两周，并使得急性HIV感染（即血清转换前的HIV感染）的检测成为可能。目前已有8家第四代商品化产品，但尚无一家通过FDA的批准。

第四代产品将抗原和抗体检测结合在同一个测试中。新近针对第四代产品的研究对比了不同检测试剂的灵敏度和窗口期，最后聚集的是最新推出的第四代产品：VIDAS HIV DUO Ultra。

   与其他第四代产品不同的是，VIDAS HIV DUO Ultra试剂可以针对抗原与抗体检测给出两个清晰的结果，对于p24抗原的最低检出限值为3pg/mL。这些特性使得急性HIV感染和/或既往感染的区分变得可能。

该产品用于包被联合抗原-抗体的微孔板的设计很是与众不同，微孔的上部包被有抗-p24单克隆抗体，孔的下部包被有用以检测IgG、IgM和针对HIV-1和2的IgA的抗原。

HIV DUO Ultra试剂是第四代产品中灵敏度最高的一个（与Enzygnost HIV Intergral、Enzymun HIV Combi、Genscreen Plus HIV Ag-Ab和AxSYM HIV Ag/Ab Combo比较），其灵敏度可以媲美单一p24检测试剂（Genetic Systems HIV-1 Ag EIA），因而可以作为p24检测的一个选择。

   急性HIV感染的筛查测试 核酸扩增检测和第四代EIA产品

   由于急性HIV感染者的临床表现总是不明显或缺乏，因而常常会漏诊。而临床上使用的标准HIV检测试剂，特别是发展中国家采用的第一代产品和美国所采用的第二代产品是不能确定急性感染病人的。当然急性HIV感染的症状、诊断和管理都超出了本文涉及的范围，故本文不再详述。

在急性感染后的两个星期左右，大约2/3的患者会出现逆转录病毒综合症的症状；其中最常见的症状是发热（80%-90%的患者会出现这一症状）、身体不适、厌食、肌肉酸痛和头痛（大约50%的患者会出现）。

虽然仍旧存有争议，但是现有的临床数据显示在血清转换之前进行治疗在短期内是对患者有益的，长期来看通过增加宿主免疫力有可能停止或推迟持续抗逆转录病毒治疗的需要。从公共卫生这一立场来看，急性HIV感染的确定也是非常重要的。

高水平的病毒血症加上缺乏对于感染的认识会使急性感染的个体成为高危险传播者。有典型的示例说明急性HIV感染者是流行的重要传播者，而流行病学研究也显示急性感染者比慢性感染者更具传染性。

   为了能诊断出急性HIV感染，就必须能检测出病人体内那些出现于血清转换前的HIV抗原。因此诊断急性感染的金标准是对HIV抗体检测阴性者进行NAAT测试。NAAT检测既能定性又能定量。定量测试能确定血浆中的病毒载量、监控疾病的进展和对抗病毒治疗的反应。

另一方面，定性检测揭示了HIV RNA的存在与否，用于筛查样品中HIV抗原的存在。APTIMA HIV 1 RNA Qualitative Assay（美国Gen-Probe公司产品）是目前唯一通过FDA认证的NAAT产品，可用于（1）HIV-1感染的诊断；（2）当HIV-1抗体检测为阳性时，确认HIV-1感染。

   由于价格高、费时和技术要求较高，所以NAAT产品并不包括在HIV常规筛查项目内。为了缩减费用，美国对献血者采用了对混合标本进行NAAT测试的方法。其做法是将所有抗体检测为阴性的样品按一定数量混合为一组，对每一组分别进行NAAT测试。

测试结果为阴性的结束筛查；如果有一组NAAT检测结果为阳性，那么就要对该组进行拆分检测或对每个样品单独进行检测，直至阳性样品被最终确定。与一个个样品单独检测相比，样品混合检测的最大好处就是大大降低了检测成本。

但是这样做有一个很大的缺点，那就是样品的混合其实也是对一个样品进行了稀释，这样一来势必会影响到测试的灵敏度。最近，公共卫生机构已经开始在某些地方试行将采用NAAT检测混合样品的做法列为常规HIV感染的筛查手段。

   如今，特别是在传统的高危人群地区，将混合样品NAAT检测作为常规测试手段的做法已备受人们推崇。目前在美国洛杉矶、旧金山、北卡罗来纳、纽约、马里兰、华盛顿、佛罗里达以及西雅图等地的HIV公共测试点正使用这种方法。

在旧金山的公共STD医疗机构中，使用NAAT进行HIV急性感染常规筛查显示HIV感染者的检出率增加了8.8%；北卡罗来纳州的数据显示检出率增加了3.9%。北卡罗来纳州和其他一些地方针对这种混合样品检测技术的研究表明，社区筛查中采用这种方法的性价比非常高。在北卡罗来纳州，每个样品的检测费用仅多花了3.63美元。

   如今，样品混合检测在样品混合的总数量、拆分样品的数量和核酸扩增试验的使用类型方面都已有所不同。目前用于混合样品检测的NAAT试验的性能对比数据还很有限，但是看起来具有低检出限值的试验表现的更为良好。接下来要做的研究是对用于混合样品检测的不同NAAT试验的性能比较进行评估分析。

   虽然NAAT检测很有前景，但在常规检测地点采用什么样的方法才是检测HIV的最佳途径还需进一步明确。到目前为止，NAAT已被列入高危人群的筛查方法中。但是在HIV低危区域，NAAT的性价比、阴阳性预测值等还是未知数。

在一定的区域，第三代或第四代EIA产品可能成为NAAT的替代品。虽然在明确急性HIV感染者的数量上第三或第四代EIA产品低于NAAT，但它们还是可以用来确定一些急性感染者的。举例来说，2003年在西雅图，通过采用NAAT方法，用于急性HIV感染的HIV-RNA筛查试验诊断出7例急性HIV感染。

其中四份样品进行了复检，这四份样品中的两份通过第三代EIA试剂检测后为阳性。一项在马拉维进行的前瞻性研究发现，在NAAT确定的HIV病例中，大约有90%都能通过快速检测试剂和p24抗原检测试剂测出。由此看来在低收入地区，第三和第四代EIA产品很有希望作为急性HIV感染检测的替代方法。当然在这些地区，可行的话还是推荐先做一个标准的EIA检测，然后进行混合样品NAAT筛查。

   快速HIV抗体检测

标准EIA检测的一个缺点在于病人大约需要两个星期才能得到结果，许多在公立检测机构进行测试的病人并不会回去拿他们的检测报告。缺乏对检测结果的随访是一个严重的问题，这一问题在那些测试为阳性或是可能已经接触了HIV的人群中的发生率最高。

而快速HIV检测试剂由于其检测过程只需要不到30分钟的时间，因而检测结果在当天即可获得；同时快速检测可在诊所或非常规检测场所诸如急诊室、社区中心等场所进行，因而使用非常方便。总的来说，快速检测与传统的EIA相比较更受病人的欢迎，并且也更容易拿到他们的检测结果——尤其是在一些非常规场合，如公共浴室等处。

   目前已有四种HIV-1/2快速诊断试剂通过了FDA认证，其中一种是可以用于唾液样品检测的OraQuick Advance Rapid HIV-1/2抗体检测试剂。这些试剂的灵敏度也已与标准第二代EIA产品做过比较。

每种快速检测试剂都在其膜上都包被有合成抗原（HIV-1的gp41和HIV-2的gp36），检测时可将样品（末梢血、静脉血或唾液）加在膜上。如果样品中含有抗gp41的抗体，那么膜就会改变颜色。另外，每种检测试剂都采用羊抗人IgG抗体作为质控，每种试剂也都需要定期采用外部质控品进行检查。

   每种快速检测试剂依照临床实验室改进修正案（CLIA‘98）的要求规定了操作人员和检测机构的类型。

没有受过正规实验室培训和在传统实验室以外进行操作的人可使用获得批准的试剂，这类检测试剂必须能够直接采用未经处理的样品（如唾液或全血），并且能够易于让那些未经过正规实验室训练的人操作。目前快速检测试剂是唯一可以在实验室外进行操作的HIV检测试剂。

   快速检测试剂的另一个优势在于它的非侵入性，比如2004年FDA批准的唾液HIV快速检测试剂。采用全血或唾液样品检测HIV1/2 抗体的OraQuick Advance Rapid HIV1/2试剂的后期市场调查显示出良好的结果。

对超过135,000全血样品和超过26,000唾液样品进行的检测结果表明，全血样品的特异性为99.98%，阳性预测值为99.24%；唾液样品的特异性为99.89%，阳性预测值为90%。虽然唾液样品的特异性稍逊于全血样品，但专家们并不想劝阻人们不要使用，这是因为该产品在非侵入性上的优势足以弥补其在特异性上的略微不足。

   虽然有关快速HIV检测试剂的数据令人鼓舞，但在使用时仍有一些地方值得我们小心。Steckler等人报告了三起OraQuick Rapid HIV-1/2抗体检测试剂漏检的早期HIV感染者，这三例病人均由随后进行的第三代EIA试剂和免疫印迹（Western Blots）所证实为HIV抗体阳性。

虽然这些案例可能是由于操作者的失误所引起，但这些发现提示在高危人群中进行RNA样品混合测试是很有意义的。假阴性结果的报告也同时强调了对于阴性结果进行正确判断的重要性。

   有待商榷和发展：尿液测试

尿液HIV检测能够检测出尿液样品中完整的HIV IgG抗体，并且该类产品已经通过FDA批准可以与EIA与Western Blot一起使用。由于尿液检测试剂的方便性和无侵入性，加之尿液可以在室温下较长期地贮存，因而采用尿液作为样品进行检测有助于HIV检测的进一步推广。

尽管尿液HIV检测拥有那么多优势，其表现也与血液检测产品相差无几（一项研究显示尿液HIV检测的灵敏度达到98.7%），但目前基于尿液的HIV检测试剂却并不常用。

   快速尿液HIV检测试剂虽然已经商品化，但尚未得到FDA的批准。Aware-Urine试剂（Calypte Biomedical公司产品）最初检测结果显示很有前途，但最近在乌干达乡村进行的研究发现其灵敏度较低。该研究表明，与采用WB确认的血清样品进行检测的EIA相比，942份尿液样品的灵敏度和特异性分别为88.7%和99.9%。

   家用HIV测试

家用快速HIV检测试剂对于提高HIV检测的使用量具有潜在的好处，但其在公共卫生等专业机构中能起到什么作用现在还不清楚。家用检测试剂的好处在于能够有效的保护隐私以及操作方便——比如不用去公立HIV检测机构或医疗机构进行检测。

迄今FDA还没有批准任何一种完整的HIV家用检测试剂盒；然而在1999年，FDA批准了第一个HIV家用样品收集品——Home Access HIV-1 Test System。使用该收集器可以使人们通过邮寄的方式将在家采集的末梢血样品寄给专业检测机构，三天以后可以通过电话查询结果。

   2006年，FDA对一种完整的快速HIV家用检测试剂——OraQuick ADVANCE 1/2进行了复审。该试剂可以用末梢血或唾液作为样品进行测试。当样品被加入测试装置后，将装置放入试剂管。测试结果可在20-40分钟内得到。

   虽然家用检测试剂的优势是那么的引人注目，但是仍然存在着许多显著的问题。目前最关注的问题在于价格；举例来说，实验室需要为每个OraQuick试剂支付12-17美元，而在零售药房，价格可能会更高。

过高的价格可能会使该类产品在高危人群中的普及使用成为一个问题，也可能阻止大众对其的接受程度。另外，在一些公立HIV检测机构，OraQuick快速检测试剂无法解释的高假阳性率也使得人们高度关注其可能会在家用测试中引发的潜在的假阳性结果。另外一些有关家用HIV检测试剂的问题还包括：

1）家用HIV检测试剂是否能扩展检测的途径？

2）客户能否正确的使用它？

3）家用HIV检测的使用者由于无法得到与医务人员面谈的机会，是否会引发潜在的危害？

4）如何保证家用样品收集器不影响公共卫生机构的操作？正是由于还存在着许多未知数，所以FDA要求OraQuick的制造商能证明其装置能被外行人正确操作。目前，Ⅱ期审查正在进行中。

HIV确认试验

所有的HIV阳性筛查结果都必须由确认试验进行确认。确认试验包括WB、间接荧光免疫抗体测试（IFA）和新近推出的已被FDA批准的核酸扩增试验——APTIMAHIV 1 RNA Qualitative试剂。

确认试验与筛查检测相比具有高度的特异性，但也更为耗时以及价格较高。IFA由于其价格昂贵且对操作人员的技术要求较高而很少被使用。WB是传统的确认试验，基于识别主要的HIV蛋白（p24、gp41和gp120/160）；改良后的WB可以确定并区别HIV-1和HIV-2型感染。

WB试验原理为单个HIV蛋白由于分子量的不同可通过电泳分离，然后被转移至硝酸纤维膜上。

将病人的血清加于膜上，如果存在抗体，它们就会与对应的抗原相结合。CDC指南是这样定义一个WB阳性结果的，即至少与主要抗原中的两个反应；而阴性结果是所有条带皆不出。如果反应结果介于阳性与阴性标准之间，则视为不确定结果。

   在EIA阳性检测结果中大约会有10%—20%的不确定结果，而临床上应考虑的是这类结果的危险因素和病人的医疗状况。某些不确定结果很可能是真的感染者，比如与p24、p31和p55有反应，但p17却似乎是真的阴性结果。

不确定结果可以是由高水平的非特异性及有交叉反应的抗体所引起的非特异性反应。在使用确认试验时，假阳性结果很少会出现，当然也不能完全排除存在的可能。假阳性结果可能会出现在伴有自身免疫性疾病的病人身上。对于不确定结果进行复检的时间一般是在2周到6个月的范围内。

   结论

自HIV肆虐25年以来，在病原学、免疫学以及HIV感染的治疗上都取得了长足的进展。与这些进展同时发展的是不同的HIV检测技术。自第一个HIV检测试剂问世以来，新的技术的不断发展增加了测试的灵敏度和特异性——缩短窗口期——使HIV感染能够更早地被检测出——通过更快速和无侵入性的检测使测试变得更为方便。

未来在快速尿液检测和采用唾液以及末梢血进行的快速RNA检测方面还有很大的改进空间。HIV检测、公共卫生和临床治疗是紧密相连的；现在所面临的最大挑战就是如何将这三者全面的联系起来，从而使得对HIV的控制和治疗取得更大的进展。

参考文献（略）

作者简介：Carina Marquez，美国旧金山加州大学医学院博士生；Nicola M.Zetola,MD，加州大学医学院感染科医生；Jeffrey D.Klausner,MD,MPH,加州大学医学院助教，旧金山公共卫生署STD预防与控制处副主任。